第9章转基因动物与动物生物反应器课件

第9章转基因动物与动物生物反应器一转基因动物的制备方法二转基因动物的应用三乳腺生物反应器四基因打靶第9章转基因动物与动物生物反应器一转基因动物的制备方1转基因动物基因工程技术胚胎工程技术转基因动物（transgenicanimal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。转基因动物转基因动物基因工程技术转基因动物2转基因动物的命名原代转基因动物:founderG0G1G2拟人化命名转基因动物的命名原代转基因动物:founderG03伦理问题人类在认识自然改造自然上的巨大进步潜在的危害伦理问题人类在认识自然改造自然上的巨大进步41982年,Palmiter生产超级小鼠

世界上第一只转基因动物:转入了生长激素基因的巨鼠（supermouse）

1982年,Palmiter生产超级小鼠

世界上第一只转基因5哺乳动物转基因技术的主要环节1目标基因克隆和体外重组2外源基因的导入3外源DNA整合、转录及表达的分子检测4转基因动物品系或品种的建立

哺乳动物转基因技术的主要环节1目标基因克隆和体外重组6哺乳动物生殖生理哺乳动物受精和妊娠，整个过程都在母畜体内进。哺乳动物生殖生理哺乳动物受精和妊娠，整个过程都在母畜体内进。7一转基因哺乳动物的制备方法显微注射法逆转录病毒载体感染精子载体介导法胚胎干细胞介导法体细胞克隆技术精原干细胞介导法

YAC介导的基因转移???一转基因哺乳动物的制备方法显微注射法81显微注射法1显微注射法9MicroinjectionintothePronucleusofaBovineZygote

MicroinjectionintothePronuc10受精卵显微注射胚胎移植后定检测显微注射法操作流程视频受精卵显微注射胚胎移植后定检测显微注射法视频11

a、转移率较高、整合效率达20%；b、外源基因长度可达数百Kb；c、可得纯系动物；d、周期相对较短。显微注射法的优点显微注射法的优点12a、设备昂贵、操作复杂；b、随机整合、首尾相连的多拷贝；c、转基因效率较低，约0.5%-3%;d、常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。缺点缺点132．逆转录病毒载体感染法

原理：当逆转录病毒的RNA进入细胞后，逆转录成DNA，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA前病毒可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。

2．逆转录病毒载体感染法原理：当逆转录病毒的RNA进入细14逆转录病毒载体逆转录病毒载体15逆转录病毒感染法特点

优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA（≦10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。逆转录病毒感染法特点163精子载体法1989年,Lavitrano等将质粒与小鼠的附睾精子，在等渗溶液中共育30min后进行体外受精和移植，产生转基因阳性小鼠并能遗传给后代。Rottman等对上述精子载体法进行了改进，其将外源DNA用脂质体包埋，再与鸡精子共同孵育，然后人工受精取得成功。Anthony等尝试了一种新的方法，预先将小鼠的精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1min，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的小鼠卵母细胞，获得成功。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜,更有利于转基因动物的产生。3精子载体法1989年,Lavitrano等将质粒与17精子与外源DNA结合的机理Smdrdora(2019)的研究结果表明。只有附睾精子和经洗涤去精清的精子才能有效地携带外源DNA，这说明精浆中某种因子强烈抑制外源DNA的结合。这些因子可能直接作用于DNA分子，也可能竞争结合在精子表面的结合部位而间接起作用。精子与外源DNA结合的机理Smdrdora(2019)的研18促进DNA与动物精子结合的方法

1共孵育法2电穿孔法3脂质体法促进DNA与动物精子结合的方法1共孵育法19精子载体法？？？？别人无法重复精子载体法？？？？204、胚胎干细胞法

4、胚胎干细胞法21

获得功能基因

构建基因打靶载体转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系

制备嵌合体

筛选进入生殖系小鼠

转基因小鼠（F1）表型分析

选择单系同胞交配产生（F2）代

筛选纯合子的转基因小鼠

胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序第9章转基因动物与动物生物反应器课件22第9章转基因动物与动物生物反应器课件23与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特的优势：

（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动物生产中发挥着极为重要的作用。与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特24基因打靶基因打靶25第9章转基因动物与动物生物反应器课件265体细胞克隆转基因技术平台5体细胞克隆转基因技术平台27第9章转基因动物与动物生物反应器课件28Clonedsheephashumangene

POLLYDOLLYClonedsheephashumangenePO29Korea：Productionoftransgenicclonedpigs

transgenicclonedpigswiththegreenfluorescentprotein

(GFP)onJune8,2019.Korea：Productionoftransgen30导入人乳铁蛋白转基因的克隆奶牛2019年初在唐山降生

导入人乳铁蛋白转基因的克隆奶牛2019年初在唐山降生316精原干细胞介导法6精原干细胞介导法32第9章转基因动物与动物生物反应器课件33第9章转基因动物与动物生物反应器课件34generationoftransgenicrats

generationoftransgenicrats

35WhichgenetransfertechniqueinvolvesatinyneedlewhichisusedtoinjectDNAintoacelllackingthatDNAsequence?

A)spermatogonialstemcellstransplantationB)liposometransferC)microinjectionD)genetargetingofembryostem(ES)cells

√Whichgenetransfertechnique36GeneticengineeringmanipulatesgeneproductsattheleveloftheA)protein.B)aminoacid.C)DNA.D)RNA.√Geneticengineeringmanipulate37转基因鸡转基因鸡38现在的工作：转基因鱼现在的工作：转基因鱼39二转基因动物的应用（1）动物品种改良；（2）生物制药(乳腺生物反应器)；（3）建立人类疾病的动物模型；（4）生产可移植用的动物器官；（5）基因治疗(动物模型)；（6）基因打靶。二转基因动物的应用（1）动物品种改良；40（1）动物品种改良抗病育种生长性状（1）动物品种改良抗病育种41（2）生物制药(乳腺生物反应器)如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。（2）生物制药(乳腺生物反应器)如荷兰的GenPhar42（3）建立人类疾病的动物模型

已建立的部分人类疾病的转基因动物模型_____________________________________________疾病模型基因转移方法转导的基因______________________________________________________老年性痴呆征显微注射β淀粉样蛋白基因Ⅱ型糖尿病显微注射胰岛淀粉样多肽基因β地中海贫血症显微注射人β珠蛋白基因镰刀形细胞贫血症显微注射人α和β珠蛋白基因唐氏综合症显微注射Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤反转录病毒转染HIVtat基因成骨不全症显微注射突变的α1胶原蛋白前体基因自毁容貌症ES细胞同源重组突变HGPRT基因_____________________________________________（3）建立人类疾病的动物模型已建立的部分人类疾病的转基因434）生产可移植用的动物器官我国每年有150万人需要器官移植，但是仅仅不到1万人能够得到供体。猪的脏器移植给人，会发生超急性排斥反应。转基因技术生产能降低或掩盖半乳糖基转移酶活性的转基因猪。如何用细胞工程解决移植器官的来源问题?Science(2019).295,1089–10924）生产可移植用的动物器官我国每年有150万人需要器官移植，44（5）基因治疗

上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治愈。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。

（5）基因治疗上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶45（6）基因打靶基因打靶(Genetargeting)是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上,定向改变生物活体遗传信息的实验手段。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代（6）基因打靶基因打靶(Genetargeting)是一种46基因打靶的研究意义基因功能研究人类疾病动物模型的研制经济动物遗传物质的改良基因打靶的研究意义基因功能研究47三个主要环节打靶载体的构建靶细胞转染与筛选由中靶细胞制备转基因动物三个主要环节打靶载体的构建48基因打靶技术根据打靶细胞的不同，基因打靶主要分为:1胚胎干细胞介导的基因打靶技术2体细胞克隆介导的基因打靶技术3精原干细胞介导的基因打靶技术基因打靶技术根据打靶细胞的不同，基因打靶主要分为:49胚胎干细胞介导的基因打靶技术首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。胚胎干细胞介导的基因打靶技术首先获得ES细胞系，利用同源重组50体细胞克隆介导的基因打靶技术家畜的体细胞克隆技术已取得突飞猛进的发展，为转基因动物的生产提供了一条新途径。直接在体细胞中进行基因同源重组，体外筛选中靶细胞，再以之为核供体获得转基因后代，是当前家畜基因打靶的一条有效途径。但是，由于体细胞体外培养的有限性和同源重组概率低，使体细胞克隆途径的基因打靶效率比胚胎干细胞途径大为降低。体细胞克隆介导的基因打靶技术家畜的体细胞克隆技术已取得突飞猛51精原干细胞介导的基因打靶技术日本研究人员Kanatsu-Shinohara等（2019）首次利用SSCs技术平台进行了基因打靶研究。他们构建了封闭蛋白Occludin基因敲除载体，电穿孔法转染体外培养的小鼠SSCs，经过筛选，获得了二株中靶SSCs集落；再选择一株中靶SSCs移植进不育小鼠曲细精管内能够重塑精子发生并产生了杂合后代，杂交后获得了纯合的基因打靶后代。精原干细胞介导的基因打靶技术日本研究人员Kanatsu-Sh52基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)53第9章转基因动物与动物生物反应器课件54基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种基因敲除的基本程序打靶载体的构建55同源重组同源重组(Homologousrecombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程,外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。同源重组同源重组(Homologousrecombinat56（6）基因打靶（6）基因打靶57正负双向选择系统

(positive-negative-selection,PNS)

同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。正负双向选择系统

(positive-negative-se58胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性59实验流程

实验流程60Genetargetingisdoneona(an)A)spermcell.B)eggcell.C)fertilizedovum.D)embryonicstemcell.√Genetargetingisdoneona(an61应用举例应用举例62肌肉生长抑制素基因

Myostatin基因敲除Myostatin基因是一种特异性骨骼肌生长发育的抑制因子。该基因与动物骨骼肌总量的调节有关，其序列在进化过程中高度保守，所有哺乳动物和鸟类均有很高的同源性。Myostatin基因在功能上也是非常保守的，其功能的缺失会造成可导致肌肉异常肥大。肌肉生长抑制素基因

Myostatin基因敲除Myosta63比利时蓝牛肌肉增加表型

比利时蓝牛肌肉增加表型64皮埃蒙特牛肌肉增加表型

皮埃蒙特牛肌肉增加表型65双肌双肌66左图为德国“娃娃超人”未满月时的照片，右图为他7个月时的照片。白色和黑色的箭头指示着他超凡的小腿和大腿肌肉

左图为德国“娃娃超人”未满月时的照片，右图为他7个月时的照片67第9章转基因动物与动物生物反应器课件68Myostatin基因敲除“超级鼠”

Myostatin基因敲除“超级鼠”69第9章转基因动物与动物生物反应器课件70美培育转基因鳟鱼：腹肌有6块,肉多15%

美培育转基因鳟鱼：腹肌有6块,肉多15%712019年生理学或医学奖诺贝尔奖美国犹他大学Eccles人类遗传学研究所科学家MarioR.Capecchi、美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院教授OliverSmithies与英国科学家卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院MartinJ.Evans因胚胎干细胞和基因打靶研究获得此奖项。v.ku6/show/OleiO4Le219wxwqb.html2019年生理学或医学奖诺贝尔奖美国犹他大学Eccles人72第9章转基因动物与动物生物反应器课件733乳腺生物反应器

mammaryglandbioreactor:

ProteinFactoryoftheFuture

1987年美国科学家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白──tPA（组织型纤溶酶原激活物），展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为乳腺生物反应器。3乳腺生物反应器

mammaryglandbiorea74转基因山羊--活动的制药厂

Mammaryepithelialcells转基因山羊--活动的制药厂Mammaryepitheli75第9章转基因动物与动物生物反应器课件76动物多肽药物用途绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿绵羊CFTR治疗囊肿性纤维化绵羊组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓绵羊凝血VIII因子、IX因子治疗血友病绵羊纤维蛋白原伤口愈合猪组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓猪凝血VIII因子、IX因子治疗血友病山羊人蛋白质C治疗血栓山羊抗血栓因子3治疗血栓山羊谷氨酸脱羧酶治疗I型糖尿病山羊Pro542治疗爱滋病牛a-乳清白蛋白抗炎症牛凝血VIII因子治疗血友病牛纤维蛋白原伤口愈合牛胶原蛋白I,II组织修复,治疗风湿性关节炎牛乳铁蛋白治疗肠道感染,感染性关节炎牛人血清白蛋白维护血液体积鸡,牛,山羊单克隆抗体用于疫苗生产动物多肽药物用途绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿绵羊CFTR治77前景转基因动物制药（乳腺生物反应器）是21世纪生物医药产业的一种新的药物生产模式。2019年世界上动物乳腺生物反应器的年产值达到500亿美元前景转基因动物制药（乳腺生物反应器）是21世纪生物医药产业78研究展望

转基因技术是近年发展很迅速的一项新技术，尚有许多问题存在，有待进一步完善，但是该技术在医学和药学等领域有着广阔的应用前景，相信转基因动物研究将极大的推动医药科学的发展。研究展望转基因技术是近年发展很迅速的一项新79第9章转基因动物与动物生物反应器课件80携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”

携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”81著名科学家谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授与曾溢滔院士在转基因牛“滔滔”模型前留影

著名科学家谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授与曾溢滔院士82曾溢滔院士与世界克隆羊“多利”之父威尔穆特博士进行学术交流

曾溢滔院士与世界克