根结线虫病诱导番茄培养基的培养

根结线虫病诱导番茄培养基的培养

根结线虫是广泛分布于世界各地的植物根系特异性寄生虫。根结线虫属寄主范围广泛,可侵染的植物超过3000种,分属114科,如蔬菜、粮食作物、经济作物和果树、观赏植物以及杂草都可被侵染。根结线虫一旦发生,很难彻底清除,连作期愈长发病愈重。在温带、亚热带、热带地区的植物受害比其他地区更为严重,病害可造成作物减产10%～20%,严重时可达75%以上,还能传播一些真菌和细菌性病害。目前关于根结线虫的分类、生物防治、基因组研究已比较深入,而其培养和保存的研究相对较少。一直以来,对于根结线虫的培养多利用活体寄主植物如盆栽番茄、拟南芥、辣椒、马铃薯、空心菜等,或者是寄主植物的组织培养离体苗和根段外植体的方式,具有作业量大、过程繁琐、耗时长的缺点。鲍时翔等(2009)发明了一种利用香蕉枯萎病镰刀菌(Fusariumoxysporumf.spcubense)培养和繁殖根结线虫的方法,解决了根结线虫的培养依赖寄主植物的问题,但该培养方法存在供试菌种单一、操作过程非常繁琐复杂的缺陷。本研究小组在其基础上进行优化和改进,简化培养过程,优化操作方法,发现了另一种可用于根结线虫人工培养的镰刀菌——牡丹根腐病镰刀菌(Fusariumsolani),用其制作二重培养基接种根结线虫悬液或卵悬液,培养出大批量根结线虫。该方法脱离了寄主植物束缚,操作更为简便,具有高效繁殖和长期保存根结线虫的优点。1材料和方法1.1样品的采集和分离从根结线虫发病较为严重的山东省泰安市房村镇的日光温室中采集根结线虫侵染严重的番茄植株的根系样品,分离根结线虫和卵。用于番茄根结线虫培养的供试菌种为牡丹根腐病镰刀菌,由山东省农业微生物学重点实验室提供。1.2根结线虫悬液的制备采用机械捣碎—过筛喷淋法。用清水洗净番茄根结样品,用剪刀将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段,放入组织捣碎均浆机中,加适量水捣碎5～10min,形成线虫与根组织碎片的混合物。将混合物倒入装有1.0%NaClO溶液的三角瓶中,使溶液没过根系,摇晃三角瓶3min。再将混合物倒入组合筛上,组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目。用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约0.5h,使线虫和卵从根组织内移到表面,被喷雾水冲洗至组合筛的底部。注意调节好水的流量,以免水溢出使线虫流失,喷淋后期使用无菌水。喷淋过后,取出组合筛中的325目筛,用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗,使线虫集中到筛的一侧,然后再用少量无菌水从筛的背面冲洗筛上物,收集液体到容器中,获得根结线虫悬液,并配成200条/ml的浓度。用同法冲洗500目筛,可制备卵悬液。1.3番茄根结线虫的人工培养方法1.3.1家蚕菌激活从斜面保藏的牡丹根腐病镰刀菌菌种中挑取一小块接种到PDA培养基中活化,在28℃的培养箱中培养3～5d。1.3.2种子培养液的制备从活化好的真菌中挑取1个菌块接种在容积为100ml内装50ml液体PDA培养基的三角瓶中,于转速180r/min、温度28℃条件下培养2d即可获得真菌的种子培养液。1.3.3双重培养基pda将获取的真菌种子培养液以每板0.1ml的量均匀涂布至固体PDA培养基中,在28℃的培养箱中倒置培养2d左右,待整个培养皿长满菌丝后即为二重培养基。用于制作二重培养基的PDA平板要适当增厚,以延长根结线虫的培养时间。1.3.4根结线虫悬浮液的制备见本文“1.2”番茄根结线虫的分离(采用机械捣碎-过筛喷淋法)。1.3.5培养基中线虫数的测定无菌条件下,将制备好的根结线虫悬液0.5ml(约100条)或卵悬液0.5ml(约100个),接至二重培养基圆心处,合盖静置1～2h使液滴浸沉,用膜封口,在28℃培养箱中倒置培养。从第二周开始,在根结线虫培养平板上菌丝消失区域均匀取样,用样品中的线虫数估算每毫升培养基中的线虫数。具体方法为:用半径为3.5mm的打孔器,打孔取培养基样品至24孔细胞培养板中,每孔2块培养基样品、1ml无菌水,搅拌均匀。每孔取40μl混合液至96孔细胞培养板,在倒置显微镜下计数,每孔重复3次观察计数,计算24孔细胞培养板每孔中线虫虫体数目,然后估算每毫升培养基中的线虫数,统计3个线虫培养平板,每周测1次,直至第9周。1.3.6培养线虫的保存对于已经进入繁殖高峰期的根结线虫培养平板,要转入冷凉条件下存放,可置15℃培养箱内。1.4naclo组合筛无菌条件下,在根结线虫培养平板上取适量培养基于容积为100ml内装40ml无菌水的三角瓶中,封口,于180r/min摇床上振荡培养10min,使线虫与水充分混合。在摇好的混合液中加入10%NaClO溶液2.1ml,使混合液中NaClO浓度为0.5%,摇晃3min。然后将混合液倒入组合筛上。用本文1.2中过筛喷淋的方法获取根结线虫悬液或卵悬液,并配置成所需浓度。1.5根结线虫网筛、孵化、收集根结线虫卵孵化的二龄幼虫是在整个线虫生活周期中对寄主植物根系具有侵染力的阶段,因此获取根结线虫二龄幼虫悬液具有重要意义。具体方法为:将根结线虫培养平板置于倒置显微镜下,用解剖针挑取其中的卵粒,置于200目网筛里,先将网筛置于0.5%NaClO溶液中摇晃3min,然后置清水中1min,并冲洗3次,再将网筛置培养皿中并使皿中的清水刚好没过筛底的卵粒,置28℃培养箱中孵化,每隔24h收集皿内的二龄幼虫,收集3次,将收集的线虫二龄幼虫悬液配至所需浓度,置4℃备用。1.6根结线虫培养平板为了获得持续和稳定的根结线虫源,需要对进入虫体繁殖密度低谷期的根结线虫培养平板进行换板传代。用本文“1.4”中的方法获取根结线虫悬液或卵悬液,然后用“1.3”中的方法,将悬液接种于二重培养基中,可继续培养根结线虫。2结果与分析2.1平板生长规律用牡丹根腐病镰刀菌制作二重培养基培养根结线虫过程中发现,接种根结线虫悬液的平板,一周后中央接种处的菌丝开始消退,消退圈逐渐向四周延伸;培养两周时平板如图1所示;培养二周半时平板菌丝即完全消失,剩下黄褐色局部暗褐色的潮湿裸露的培养基,而且此时培养基具有软度大、较松散、难以用镊子夹取等特点。对于接种卵悬液的平板,试验结果与接种线虫悬液的平板相似,只是中央菌丝消失时间要比接种线虫悬液的平板晚,两周时菌丝开始消退,三周半左右才可消失完全。由平板变化现象可知,接种线虫悬液后,线虫需要一段时间来适应平板环境,然后才开始取食菌丝。而接种卵悬液的平板菌丝消失时间要比接种线虫悬液的平板晚,这是由于卵适应平板环境后还需要先孵化成二龄幼虫,然后再取食菌丝所致。2.2虫口密度和生物量由图2可知,在接种线虫悬液的平板内,根结线虫不断繁殖,到第三周线虫密度达到最高峰,约为2300头/ml培养基,然后随着时间的延长,平板内菌丝减少,空间拥挤,代谢废物增加,使根结线虫生存条件下降,线虫虫口密度不断降低,到第九周时,线虫密度约为120头/ml培养基,仅为高峰期的5%。接种卵悬液的平板,在第四周虫口密度达到最高峰,约为2000头/ml培养基,第九周时,虫口密度约为240头/ml培养基,为高峰期的12%。从线虫密度总变化趋势来看,在第六周进行根结线虫换板传代培养最适宜。第四周到第九周,虫体密度变化趋势在局部(接种线虫悬液的平板在第七周,接种卵悬液的平板在第五周)呈不正常凹陷,可能是因为平板内部分区域线虫虫体密度不均所致,但不影响虫口密度变化总趋势。将牡丹根腐病镰刀菌菌丝完全消退后的根结线虫培养平板转入15℃条件下存放,5个月后培养基内仍有可供继代繁殖的活虫体。3其他树种对根结线虫的培养效果根结线虫的分类研究已十分深入,生防研究也已在世界各国广泛开展,而关于根结线虫培养保存的研究却相对较少。国外一些学者将根结线虫在离体拟南芥和番茄上进行繁殖,但试验条件要求高,要在严格无菌条件下。Barker等人介绍的根结线虫繁殖方法,设备和程序复杂,不易应用。王汝贤等(1999)在Lambert等(1992)水培法的基础上简化改进,形成根结线虫的一种水培繁殖方法。吴庆丽等(2006)在比较根结线虫在番茄和马铃薯上培养效果的基础上,研究了不同马铃薯品种对根结线虫的培养效果,并对其光照条件进行了研究。焦春伟等(2012)利用空心菜适应性强且在沙培浇灌营养液条件下生长周期长、易管理的特点,用其培养爪哇根结线虫和花生根结线虫取得较好效果。目前国内外根结线虫的人工培养主要还是依靠盆栽番茄、拟南芥、辣椒、马铃薯、空心菜或其他寄主植物,存在作业量大、周期长、寄主对环境条件的适应性差、过程繁琐或不易管理等问题。鲍时翔等(2009)用香蕉枯萎病镰刀菌培养植物根结线虫取得较好效果,但其方法存在供试菌种单一,操作过程非常繁琐复杂的缺陷。本试验在鲍时翔方法的基础上对其培养方法进行优化和改进,简化培养过程,优化操作方法,发现了一种可用于根结线虫培养的