脑络欣通对脑中动脉闭塞缺血-再灌注大鼠血液流变学及相关调节因子的影响

脑络欣通对脑中动脉闭塞缺血-再灌注大鼠血液流变学及相关调节因子的影响

中医认为，血液在“浓、粘、集、聚”状态下的血流缓慢，导致血栓形成和梗死于局部脑组织血液循环障碍。这是缺血性脑病最重要的病理机制之一。脑络欣通是新安医家王乐匋先生的临床验方,为新安医学益气活血法的代表方剂,对缺血性脑血管病的疗效显著。本研究通过观察大鼠模型血液流变学指标、内皮素(endothelin,ET)、血小板生成素(thrombopoietin,TPO)及局部脑血流量(regionalcerebralbloodflow,rCBF)的变化,探讨其治疗缺血性脑血管病可能的机制,为脑络欣通的开发和临床应用提供理论依据。1材料和方法1.1模型分组及分组取健康雄性清洁级Wistar大鼠60只,2月龄体质量为250～300g,由安徽医科大学实验动物中心提供[许可证号:SCXK(皖)2011-002]。采用随机数字法分成假手术组、模型组、通心络组、脑络欣通低剂量组(40mg/ml)、脑络欣通中剂量组(80mg/ml)、脑络欣通高剂量组(100mg/ml),每组10只。独立送风隔离笼具(康为IR60)饲养,笼内温度控制在(22±1)℃的范围内,相对湿度为60%。1.2颈动脉血流动力学参照Longa等的方法,制作大脑中动脉闭塞缺血-再灌注(middlecerebralarteryocclusion/reperfusion,MCAO/R)大鼠模型。腹腔注射10%水合氯醛,按照35mg/100g的剂量麻醉大鼠,常规消毒,钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),电凝枕动脉和甲状腺上动脉,将ECA远心端结扎两处。用动脉夹夹闭CCA、ICA和ICA的分支翼腭动脉近心端。从ECA两结扎处中间剪断,轻拉ECA使之与ICA成直线,在ECA近游离端斜剪“V”形切口,快速置入栓线,置入ICA约(18.0±0.5)mm,至感觉有少许阻力为止,造成局灶性脑缺血,2h后拔出栓线少许(约5mm)造成缺血-再灌注损伤。假手术组不插线,仅做颈动脉分离。手术过程中用激光多普勒仪监测缺血区局部脑血流量(rCBF),再灌注之前rCBF降低到开始水平的70%以下且苏醒后神经功能缺损评分为2～3分者为模型制作成功。模型制作成功45只,死亡5只,死亡率为8.3%。1.3试剂盒通心络胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司生产,国药准字Z19980015,批号为110819,0.26g/粒);血液流变学指标检测试剂盒由上海长岛生物技术有限公司提供;ET(批号20110526)试剂盒和TPO(批号20110310)试剂盒由上海源叶科技有限公司提供;IKA-HB10旋转蒸发仪(郑州长城科工公司);Sigma2-16PK冷冻离心机(美国Sigma公司);FD-1C-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);LBY-N6C0MPACT全自动血液流变仪、高性能血凝仪C2000-2(北京普利生仪器有限公司);Thermo-1510酶标仪(美国热电公司)。1.4脑络欣通冻干粉的制备脑络欣通溶液(专利号:201110462364.8)制作方法参照文献。脑络欣通由黄芪、红花、三七、川芎、蜈蚣、当归、天麻组成,按15∶5∶2∶3∶1∶5∶5比例,共502.2g制成中药饮片,购于安徽中医学院国医堂门诊部,于高速中药粉碎机内制成药粉,自动煎药机中煎煮过滤去滓。冷冻离心机离心去滓(4℃,4000r/min,5min),旋转蒸发仪低压低温浓缩至197ml,于冷冻干燥机内低温真空环境(-45℃,<20Pa)制成脑络欣通冻干粉共51.3g。最后将脑络欣通冻干粉配制成浓度分别为40、80、100mg/ml的溶液。通心络胶囊配制成浓度为0.03g/ml的溶液。通心络组、脑络欣通组大鼠按照1ml·100g-1·d-1的剂量在造模后连续14d灌胃给药。给予模型组和假手术组大鼠等渗盐水。1.5变学指标的检测造模后第14天从腹主动脉采血,将其中4.5ml保存于肝素抗凝管用于血液流变学指标的检测;0.7ml保存于柠檬酸钠抗凝管中用于纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)的检测,3ml保存于普通管中用于TPO和ET的检测,冷冻离心机(4℃,2000r/min,10min)分离血清,-70℃保存。1.6测试指标1.6.1fib含量检测采用全自动血液流变仪检测全血高、中、低切黏度、血浆黏度、红细胞比容(hematocrit,HCT);C2000系列高性能血凝仪检测FIB含量;运用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测TPO和ET水平,严格按试剂盒的说明进行各项操作,在450nm波长处测定各孔吸光度值,然后转换为浓度,最后统计数值。1.6.2周边组织监测运用激光多普勒仪,于造模后第14天监测各组大鼠的rCBF。选取手术侧梗死灶及其周边组织作为监测区域。大鼠被麻醉后取俯卧位,沿颅骨正中偏右切开皮肤及皮下组织,钝性分离筋膜,暴露颅骨,定位头部右侧距矢状缝2mm、冠状缝前1mm处,用生物胶将激光多普勒仪的探头座固定于此,安装连接探头,常规调试仪器和校准。1.7最小显著法least-ssificantdiffercediff数据分析应用SPSS17.0统计软件包,计量资料结果全部采用x¯±sx¯±s表示,采用单因素方差分析,经正态性检验和方差齐性检验后,方差齐时采用最小显著法(Least-significantDifference,LSD)进行两两比较,方差不齐时用Games-Howell法,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠脑络欣通、脑络欣通中剂量和高剂量对大鼠脑络欣通低剂量的影响假手术组、通心络组、脑络欣通3个剂量组大鼠的全血黏度各项、血浆黏度、HCT和FIB指标均低于模型组,差异有统计学意义,P<0.01。通心络组、脑络欣通中剂量和高剂量组的HCT低于脑络欣通低剂量组,差异有统计学意义,P<0.01。脑络欣通中剂量和高剂量组的FIB低于脑络欣通低剂量组,差异有统计学意义,P<0.05;脑络欣通中剂量组的FIB低于通心络组,差异有统计学意义,P<0.05。见表1。2.2模型组与正交组p组的统计学分析假手术组、通心络组及脑络欣通3个剂量组大鼠的TPO、ET水平均低于模型组,rCBF高于模型组,差异具有统计学意义,P<0.01或P<0.05;脑络欣通中剂量组大鼠TPO水平低于脑络欣通低剂量组,rCBF高于脑络欣通低剂量组,差异具有统计学意义,P<0.05;脑络欣通低剂量组大鼠rCBF低于通心络组,差异具有统计学意义,P<0.05。见表2。3讨论3.1脑梗死与血浆黏度血液流变学的改变、凝血纤溶系统的失衡、血栓形成所致的局部脑组织灌注不足是缺血性脑血管病主要的病理生理学机制,而三者之间密切相关。凝血功能亢进、纤溶功能降低则会引发血栓形成,直接改变血液流变性,而血液流变学的改变又可影响凝血、纤溶之间的平衡。这在缺血性脑血管病的发生发展过程中,起到了关键作用。血液流变学指标反映了血液的黏滞性、浓稠性及凝固性等。血黏度是血液最基本的流变特性,是血液流变学研究的中心环节,主要包括全血黏度和血浆黏度,与血液流动性呈负相关,却与缺血性脑血管病的发生率呈正相关。一方面,血黏度增高易造成血流缓慢,直接导致脑组织灌注不足而发生缺氧及代谢障碍,促进血栓形成;另一方面,血黏度增高又可导致血管壁物理性损伤和内皮细胞损伤,为血小板聚集提供机会,促进血栓形成。HCT反映血液黏稠性,也是影响血黏度的重要因素。血黏度与HCT呈正相关,也与缺血性梗死的体积呈正相关。同时,随着血黏度的升高,过多脂质吸附于红细胞表面导致细胞间排斥力下降,使得红细胞聚集性增强而影响着血液流变学。林智等的研究结果表明,脑梗死患者血浆渗透压与全血高切、低切黏度及血浆黏度均呈正相关性。首先,血黏度升高和红细胞聚集性增强可导致血液流动过程中耗能增加;其次,红细胞本身聚集性的改变又会导致全血黏度的升高而造成血流缓慢。全血黏度、红细胞刚性增高使作用于血管内皮的切应力增加,促使血管内皮损害,有致血栓形成的可能,引发脑血管病。红细胞变形性降低又可使其储氧和释氧能力减弱,这又将加重缺血时的脑组织损伤。FIB作为凝血因子Ⅰ在血栓形成过程中扮演着重要角色。FIB是血浆黏度增高的主要因子,更是血栓病变的主要基质。FIB刺激血管膜中的平滑肌细胞增殖并使其向血管内膜迁移,而最终形成斑块中的泡沫细胞。另外,血小板膜上含有大量FIB黏附受体,FIB通过与这些受体结合而发生血小板聚集,所以血浆FIB水平增高不仅使血浆黏度增加而影响组织血流灌注,而且还使血小板聚集性增强,促使血栓形成。研究表明,FIB水平的升高与动脉粥样硬化血栓合并症的发生、发展密切相关。脑梗死患者血浆FIB浓度的升高是脑血管疾病发病的重要危险因素。总之,脑梗死发病与高血压、脂质代谢异常、肥胖等危险因素有关,而这些危险因素都与血液流变学的改变密切相关。ET和TPO是凝血纤溶系统相关调节因子,当血管内皮受损时内皮细胞分泌并激活TPO和ET,导致凝血功能亢进及动脉痉挛,形成栓塞。ET作为强效血管收缩剂参与脑梗死的发生、发展,ET可引起脑血管痉挛、脑水肿导致颅内压升高,加重脑缺血缺氧状态。而TPO有特异性调节血小板的作用,作为血小板活化的标记物,在导致血栓形成的过程中起到关键作用。3.2中药药养血药实验结果表明,一方面脑络欣通能明显改善模型大鼠异常的血液流变学指标。脑络欣通能够降低血浆FIB的水平,调节由MCAO/R造成的TPO、ET异常分泌,具有减少血栓形成,降低血液高凝状态的作用。同时,通过降低ET和升高rCBF,可以改善低灌注的状态,降低缺血梗死区的体积,为缺血性脑血管病后期的神经功能恢复奠定基础。脑络欣通中含有黄芪、红花、三七、川芎、蜈蚣、当归和天麻等7种中药。根据中医药理论,该方具有益气、活血、通络等功效。结合现代中药药理学研究,黄芪含有苷类、多糖和黄酮等化学成分,具有降低血小板黏附力,减少血栓形成及降低血脂的药理作用;红花中含有红花醌苷等成分,三七含有的皂苷和黄酮苷等成分,均能抑制血小板的聚集,增强纤维蛋白的溶解,降低全血黏度,且能扩张脑血管,改善微循环,增加脑血流量。另外,红花黄素能延长凝血酶时间,抑制血小板聚集,具有预防血栓形成的作用;红花醇提取物和红花苷等成分能显著提高耐缺氧能力,对缺血性脑血管病有保护作用;蜈蚣煎剂及天麻醇提取物能改善微循环,降低脑血管的阻力,延长凝血时间,降低血黏度等。脑络欣通能增加患侧rCBF,这