TCVMA 126-2023 规模化养殖场奶牛乳房炎常见致病菌检测技术

ICS65.020.30CCSB41团 体 标 准T/CVMA126-2023规模化养殖场奶牛乳房炎常见致病菌检测技术Detectiontechnologyofcommonpathogenicbacteriaofdairycowmastitisinlarge-scalefarms2023-7-14发布 2023-7-14实施中国兽医协会 发布T/CVMA126—2023前  言GB/T1.1—20201部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件主要起草人：李彦、赵永达、段笑笑、曲志娜、郭莉莉、刘蒙达、杨胜男、马帅、王洪波、IT/CVMA126—2023规模化养殖场奶牛乳房炎常见致病菌检测技术范围本文件确定了规模化养殖场奶牛乳房炎的样品采集、登记、实验室检测和记录的程序。本文件适用于奶牛疑似乳房炎的确诊。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。NY/T2692 奶牛隐性乳房炎快速诊断技术NY/T2962 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。奶牛乳房炎 bovinemastitis多由机械性刺激、病原菌浸入及化学物理性损伤所致的乳房实质、间质的炎症。。临床型乳房炎clinicalmastitis乳房和乳汁有肉眼可见临床变化的炎症。隐性乳房炎subclinicmastitis（泌乳期lactationperiod奶牛从分娩后开始泌乳之日起到停止泌乳（人工停乳或自然停乳）之间的一段时间。干乳期dryperiod经产奶牛从停止泌乳之日起到分娩后重新泌乳之间的一段时期。1T/CVMA126—2023病原菌 pathogenicbacteria可以侵犯机体，引起感染甚至传染病的微生物。注：或称病原体。病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。感染奶牛乳房炎的常见病原菌包括传染性病原菌、环境性病原菌。临床诊断临床型乳房炎无临床症状的乳房炎等发生变化，且能分离到可致病的病原菌。致病菌的分离样品采集外观观察对疑似患病奶牛采样前，应对奶牛的整体状况，包括精神状态、乳房外观、乳汁性状等进行观察。试剂与材料参考附录A中的规定，结合CLSI中规定的进行。乳房清洁乳头周围无污物，用专用消毒毛巾或一次性纸巾擦除乳头表面的灰尘和污物。若整个乳房较脏时，0.2%75%酒精进行消毒。乳头清洁清洗乳头分为淋洗、擦干、按摩。淋洗后用干净毛巾或纸巾擦净。采样和保存435mL以上乳汁于无菌采集管中。采集的乳汁样品应在2°C～8°C条件下冷藏，尽快送检，也可置2°C～8°C低温保存待检。2T/CVMA126—2023样品记录包括样品种类、奶牛场名称、地址、牛编号、乳室、采样日期、送检日期、收样人等详细信息。实验室诊断细菌的分离培养按照NY/T2692、NY/T2962、CLSI[1]的规定进行操作。常见病原菌的培养参考附录A的规定进行。细菌的鉴定[2]16PCR检测试16SRNA（16SrRNA）基因测序技术。乳汁体细胞检测按照NY/T2692规定进行判定，也可采用商品化的隐性乳房炎诊断试剂进行检验判定，乳汁中的体细胞数量异常升高。或按加州乳房炎检测法（CaliforniaMastitisTest，CMT），将采集的疑似患病奶牛的乳汁，在表面活性物质和碱性药物作用下，使乳中体细胞被破坏，释放出DNA，按CMT操作说明及判定标准，进行奶牛隐性乳房炎的判定。一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值（＋）；超过该值为阳性，低于该值则正常。如采用CMT法，可按表1进行判定。表1 CMT法的判定方法及标准反应判定被检乳反应状态体细胞数（千/毫升）－阴性混合物呈液体状，倾斜检验盘时，流动流畅，无凝块0～200±可疑混合物呈液体状，盘底有微量沉淀物，摇动时消失200～500＋弱阳性500～800＋＋阳性全部呈凝胶状，有一定黏性，回转时向心集中，不易散开800～5000＋＋＋强阳性混合物大部分或全部形成明显的胶状沉淀物，黏稠，几乎完全黏附与盘底，旋转摇动时，沉淀集于中心，难以散开＞5000档案与记录3T/CVMA126—2023B。4T/CVMA126—2023附 录 A（资料性）常见病原菌的培养基及培养条件表A.1给出了常见病原菌的培养基及培养条件。表A.1 常见病原菌的培养基及培养条件病原菌培养基培养条件金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4无乳链球菌血琼脂培养基35℃培养18h～24h停乳链球菌血琼脂培养基35℃培养18h～24h牛支原体PPLO（20%马血清pH7.9最佳CO2条件培养5d～7d乳房链球菌血琼脂培养基55℃培养1d～2d凝固酶阴性葡萄球菌血琼脂培养基35℃18h～2448h～72h肠球菌血琼脂培养基37℃培养18h大肠埃希氏菌营养琼脂培养基37℃培养6h～8h肺炎克雷伯氏菌营养琼脂培养基37℃培养12h～18h产气肠杆菌血琼脂培养基35℃培养18h～24h沙雷氏菌普通琼脂培养基25℃～30℃培养1d～2d变形杆菌普通琼脂培养基在20℃～40℃之间繁殖旺盛志贺氏菌普通琼脂培养基37℃培养12h～18h沙门氏菌普通琼脂培养基37℃培养12h～18h绿脓杆菌普通琼脂培养基培养最适生长温度为35℃，pH为7.2，CO25%～10%有助于生长化脓放线菌血琼脂培养基最适生长温度37℃，20℃～40℃生长牛棒状杆菌普通琼脂培养基最适生长温度37℃巴氏杆菌普通琼脂培养基最适生长温度37℃5T/CVMA126—2023附 录 B（资料性）奶牛感染乳房炎档案记录表表B.1给出了奶牛感染乳房炎档案记录表。表B.1奶牛感染乳房