小柴胡汤及柴胡小柴胡汤和柴胡黄芩含药血清对CCl

小柴胡汤及柴胡小柴胡汤和柴胡黄芩含药血清对CCl

小柴胡汤是东汉张仲景在《伤寒杂病论》中提出的一种疾病。它由柴胡、黄药、半夏、生姜、胡萝卜、甘草和枣组成。小柴胡汤临床上常用于治疗各种急慢性肝病,动物实验研究表明小柴胡汤具有抗急慢性肝损伤的作用,且体内抗肝损伤的主要药味为柴胡—黄芩。CCl4肝细胞损伤体外模型的化学损伤的机制为何?是否有凋亡的参与?小柴胡汤及柴胡—黄芩配方对这种损伤是否有保护作用?目前尚未见报道。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物中心SD大鼠,♂,体重220～250g,合格证号:SCXK(京)2002～0003,购自北京维通利华实验动物中心。在室温(20±2)℃环境下分笼饲养,光照12h(AM8:00～PM8:00)。实验前适应环境饲养1wk。1.1.2细胞植物BRL-3A大鼠肝细胞株,引自中国科学院上海细胞所。1.1.3小柴胡汤方汤液的制备柴胡、黄芩、半夏、生姜、人参、甘草、大枣共七味药,购自北京同仁堂药店,经北京中医药大学中药鉴定教研室鉴定系正品。小柴胡汤及柴胡—黄芩配方汤液的制备:小柴胡汤全方按全国统编五版教材《方剂学》所载,由柴胡12g,黄芩9g,半夏9g,生姜9g,人参9g,甘草6g,大枣12g组成;柴胡—黄芩配方由柴胡12g,黄芩9g组成。药材经自来水浸泡40min,第1遍煎煮时加7倍水,第2遍加5倍水。严格控制煎煮时间,沸腾后,用控温电炉保持微沸30min。合并2次煎液,脱脂棉过滤,90℃水浴浓缩至2000g·L-1浓度。冷藏保存。1.1.4酶解-pc-msmtt及姬姆萨原液dmsoRPMI1640培养基:GBICOCo,用时溶于1L双蒸水中,加入2.0gNaHCO3,调pH值7.0～7.2,过滤除菌,并入青霉素100mg·L-1、链霉素100mg·L-1。胰蛋白酶:SigmaCo。胎牛血清:HycloneCo。MTT:SigmaCo。CCl4、二甲基亚枫(DMSO):SigmaCo。姬姆萨(Giemsastain)染液配制:称取姬姆萨染料0.8g,加入50ml甲醇,加温至58℃,搅拌约2h待染料彻底溶解后缓慢加入50ml甘油,充分摇匀,置于37℃温箱中保温10h。密封保存,即为姬姆萨原液。一般在12～24h后即可使用。临用时取1ml姬姆萨原液与9mlPBS混合,即为姬姆萨工作液。1.2方法1.2.1水合氯醛麻醉♂SD大鼠24只,随机分为3组,每组8只,即正常对照组、小柴胡汤全方组(G)、柴芩组(A)。各中药组分别给予中药(剂量相当于人临床有效剂量的12倍)灌胃,每日1次,连续给药5d。正常对照组给予等体积蒸馏水。于末次给药2h后,腹腔注射体积分数为0.1的水合氯醛麻醉,无菌条件下腹主动脉采血,置无菌试管内。待凝固后37℃水浴1h,3000r·min-1,离心15min,分离血清,-20℃冰箱冻存备用。临用时,56℃恒温30min灭活,用无血清培养基稀释,过滤除菌。1.2.2悬浮细胞的制备BRL-3A肝细胞,2.5g·L-1胰蛋白酶消化液消化3～5min,加入胎牛血清及时终止胰蛋白酶反应,收集消化液,置于50ml离心管中。离心1000r·min-1,5min。用含有100ml·L-1胎牛血清的1640培养液悬浮细胞,调细胞浓度为1×108·L-1分装于50ml培养瓶中。置于37℃、CO2培养箱中培养。1.2.3ccl4模型的制备肝细胞培养至对数生长期,用2.5g·L-1胰蛋白酶消化液消化细胞2～3min,置于50ml离心管中,加入血清终止反应。离心,1000r·min-1,5min,清洗1次。用含100ml·L-1胎牛血清的1640培养液重悬细胞,调细胞浓度为1×108·L-1。细胞接种于96孔板中,各孔加入100μl细胞液,置于37℃、CO2培养箱中贴壁培养24h。随机分为4组,每一列为一组,按顺序依次为:N(正常对照组),M(模型组),A(柴胡—黄芩组)、G(小柴胡汤全方组)。各组吸弃原培养上清,然后分别加入10%相应含药血清培养液,同时各孔(除正常对照组外)加入CCl4(少量DMSO助溶),CCl4终浓度为10mol·L-1。置于37℃、CO2培养箱中,静止培养24h。1.2.4指标观测1.2.4.1tt测量试验重复3次。1.2.4.2gpt测量采用赖氏法,按试剂盒说明书用722分光光度计测定GPT含量,其单位含量为卡门单位/L。1.2.4.ccl4诱导的细胞毒性检测对数生长期肝细胞调细胞浓度为4.5×107·L-1,将细胞接种于12孔培养板(或已置入无菌盖玻片),置于37℃、CO2培养箱中培养24h。分组及加药同上。将12孔培养板直接置于倒置显微镜下观察,比较经过CCl4诱导的和未经诱导的细胞形态、大小和凋亡细胞的出现。取出细胞爬片,晾干后用甲醇固定10min,晾干,放入姬姆萨染色工作液中,室温染色10min。PBS分色,蒸馏水清洗,室温干燥24h。用二甲苯浸泡透明,以树脂封片。普通光学显微镜下观察细胞形态。1.2.4.细胞悬液的制备肝细胞调细胞浓度为4.5×107·L-1,接种于6孔板,置于37℃、CO2培养箱中培养,培养48h。每块板随机分为4组,即N(正常组)、M(模型组)、A(柴芩组)、G(全方组)组。各组加入相应的体积分数为0.1的含药血清培养液,同时各孔加入CCl4(少量DMSO助溶),CCl4终浓度为10mol·L-1。置于37℃、CO2培养箱中,静止培养24h。将培养瓶中的液体全部收集到5ml离心管中,每个培养孔中加入1ml2.5g·L-1胰酶以消化细胞,将消化下来的细胞收集到相应的离心管中,1000r·min-1,离心10min。收集细胞,用4℃PBS洗细胞,1000r·min-1,离心5min,清洗2次。用预冷的终浓度为体积分数0.70的乙醇固定细胞,放置4℃冰箱过夜。固定好的细胞离心收集,去上清,再用4℃PBS洗细胞2次,最后于离心管中留取0.5～0.6ml细胞悬液,加入20mg·L-1RNase,于37℃水浴30min。用50mg·L-1浓度的碘化丙啶染色,4℃避光放置60min。细胞悬液混匀,过200目尼龙网,流式细胞仪(FACSCalibur美国BD公司)检测。应用CELLQUEST软件获取细胞10000个,进行凋亡细胞记数,以MODIFIT软件进行凋亡拟合。1.2.5统计处理各组数据用ˉx±s表示。各组数据采用方差分析(ANOVA),多组间比较采用q检验,全部数据用SPSS10.0统计软件处理。2细胞形态观察2.1小柴胡汤及柴胡-黄芩配方的含药血清对CCl4诱导的肝细胞增殖的影响2.2小柴胡汤及柴胡-黄芩配方的含药血清对CCl4诱导的肝细胞培养上清液GPT的影响2.3小柴胡汤及柴胡-黄芩配方的含药血清对CCl4诱导的细胞的显微形态观察Giemsa染色片光镜下观察到,正常组细胞核染成粉红色,细胞圆形或类圆形,细胞质淡蓝色形状规则,可见细胞分裂相。模型组细胞分布较稀疏,处于分裂期细胞明显增多。多细胞可见明显的凋亡形态改变:细胞出现发泡现象,细胞染色质浓缩、出现靠近核膜和核着边现象,核膜裂解、染色质分割成块状;细胞周围可见多个完整膜包裹的凋亡小体(见Fig4);偶可见坏死细胞,细胞肿胀崩解,形态不规则。小柴胡汤和柴芩组细胞分布较模型组密集,细胞形态完整,处于分裂期细胞多于正常组,但少于模型组,偶可见凋亡细胞。2.4小柴胡汤及柴胡-黄芩配方的含药血清对CCl4诱导的肝细胞凋亡的影响3含药血清对ccl4细胞凋亡和凋亡的影响Marc等在体外温育的肝细胞观察到CCl4损伤时产生二个时相的变化,最初快速损伤在给与CCl4后几分钟即发生,不受抗氧化剂的影响,脂溶性的CCl4通过直接膜溶解作用对肝细胞造成损伤。CCl4能直接损伤游离的肝细胞膜和线粒体。由于CCl4分子本身的损伤作用比较弱,肝细胞损伤的第二时相变化发生在3～5h以后,与CCl4的代谢有关。目前认为,CCl4引起肝细胞中毒的机制是CCl4经肝细胞微粒体细胞色素氧化酶系统代谢、激活后,生成CCl3,CCl3攻击肝细胞膜或激活膜上的磷酸化酶,引起细胞膜和细胞器质膜过氧化损伤。实验中体外培养的肝细胞加入10mol·L-1CCl4溶液24h后,细胞增殖率下降,体积分数为0.1的小柴胡汤和柴芩含药血清组的细胞增殖率较模型组提高。结果表明,CCl4抑制肝细胞增殖与其毒性作用有关,小柴胡汤和柴芩组的含药血清具有不同程度对抗CCl4引起的肝细胞增殖率下降的作用。与正常组相比,模型组细胞培养上清液中的GPT含量升高。加入体积分数为0.1的小柴胡汤和柴芩组含药血清各组的细胞培养上清液中的GPT降低,表明10mol·L-1CCl4在体外可以损伤肝细胞,小柴胡汤和柴胡—黄芩含药血清对体外CCl4肝细胞损伤有保护作用。小柴胡汤和柴芩的含药血清给药法,避免了中药复方制剂直接体外用药的一系列干扰因素,其特点为不但能反映中药(母体药物)及其可能的代谢产物的药理作用,而且还能反映有可能由药物诱导机体而产生的内源性成分所产生的作用。通过对倒置显微镜下直接观察和Giemsa染色观察,发现体外10mol·L-1CCl4引起的肝损伤同时存在着明显的凋亡和坏死。而小柴胡汤和柴芩组只是偶见凋亡,表明小柴胡汤和柴芩可能具有抗CCl4诱导的肝细胞凋亡的作用。1972年,Kerr等首次提出了“细胞凋亡”的概念。已有不少研究发现体内给以CCl4引起肝细胞凋亡的证据,并了解到体内CCl4对肝细胞凋亡的影响存在剂量依赖关系,小剂量时以凋亡多见,大剂量时则以死亡为主。但目前有关体外CCl4诱导肝细胞凋亡的研究尚未有见,对小柴胡汤体外抗CCl4损伤的研究也很少见。本研究运用流式细胞仪进行定量分析,发现10mol·L-1CCl4可引起肝细胞G1期前出现明显的Ap亚峰即凋亡峰,凋亡率增高。与模型组相比,柴芩、小柴胡汤组的凋亡率均有不同程度降低。这些结果进一步表明,10mol·L-1CCl4可以诱导肝细胞凋亡,小柴胡汤及柴芩组有对抗CCl4诱导的肝细胞凋亡的作用。结论:①CCl4体外引起的肝细胞损伤同时存在着明显的凋亡和坏死。②小柴胡汤和柴胡-黄芩含药血清对体外CCl4诱导的肝细胞损伤有保护作用,可能具有抗CCl4诱导的肝细胞凋亡的作用。结果见Tab1。由Tab1可以看出,与正常组相比,模型组细胞增殖率明显降低(P<0.01);与模型组相比,小柴胡汤及柴芩配方组的细胞增殖率明显增高,差异均有显著性(P<0.01);全方组(G)细胞增殖率高于柴芩(A)。结果见Tab2。从Tab2可以看出,与正常组相比,模型组细胞培养上清液中GPT含量增高(P<0.01)。与模型组相比,小柴胡汤和柴芩组细胞培养上清液中GPT含量均降低(P<0.01)。倒置显微镜下观察到,正常组细胞生长状态良好,融合成片,呈圆形、类圆形、多角形或梭形