多模态智能化纳米分子影像探针及其在结直肠癌诊断与研究中的应用

项目名称首席科学家起止年限依托部门多模态智能化纳米分子影像探针及其在结直肠癌诊断与研究中的应用高明远中国科学院化学研究所2010.9至2015.9中国科学院#二、预期目标总体目标本项目围绕直肠癌微小肿瘤的早期诊断、转移预警以及疗效预测等关键难题，以磁性氧化铁纳米颗粒为核心构建多模态智能化纳米分子影像探针；结合现代影像学技术，发展多模态分子影像探针在结直肠癌微小肿瘤早期诊断中的应用方法及智能化探针在肿瘤相关微环境高灵敏度探测中的应用方法；建立与结直肠癌恶性生物学行为密切相关的信号转导通路及上皮细胞间质化的可视化方法，从多尺度，多层面提供肿瘤相关信息。通过本项目的实施及相关前瞻性研究工作的开展，强化我国在相关领域的领先地位，培养出具有国际竞争力的跨学科优秀人才，并且获得一批高水平、拥有自主知识产权的研究成果。五年预期目标1．建立高灵敏度多模态分子影像探针的构筑方法，建立基于多模态分子影像探针在肿瘤早期诊断及鉴别诊断中的应用方法。2．建立灵敏度高、特异性强的智能化纳米探针的构筑方法及肿瘤转移预警的分子影像方法，同时揭示肿瘤病灶中金属离子浓度及pH值异常变化与肿瘤发生发展过程的相关性。3．通过肿瘤细胞信号转导通路研究，建立靶向EGFR药物的疗效预测可视化方法。通过上皮细胞间质化过程的可视化及恶性生物学行为的在体分子影像，建立肿瘤早期转移预警的可视化方法。4．建立多模态分子影像平台及多模态影像信息处理方法，建立纳米探针的在体动态可视化技术，为结直肠癌的早期诊断、转移预警及疗效预测提供分子影像手段。5．通过本项目的实施及相关前瞻性研究工作的开展，强化我国在相关领域的领先地位，获得一批高水平、拥有自主知识产权的研究成果，申报发明专利10-15项，发表80篇以上具有重要国际影响的学术论文，进一步推动我国在肿瘤分子影像领域的发展。6．培养一批跨学科优秀人才，为我国在该领域的可持续、高水平地发展做出贡献，包括：培养数名青年学者得到国家杰出青年基金，教育部长江特聘教授，培养研究生40-60名。三、研究方案一）总体思路结直肠癌早期诊断、肿瘤转移、疗效预测分子

影像探针的构建及应用方法肿瘤多模态分子影像探针在体动肿瘤微环境与肿瘤发生发展的关态可视化影像方法系、肿瘤转移预警与疗效预测高灵敏度多模态分肿瘤多模态肿瘤微环境肿瘤重要分子事件子影像探针分子成像智能化探针动态可视化■（课题一）（课题四）R（课题二）（课题三）肿瘤的早期诊断、转移预警及疗效预测

纳米科学技术+化学、分子生物学、肿瘤学、药学、影像学图1.本项目的总体研究方案本项目的总体思路是以解决国家重大需求为目标，以结直肠癌的临床诊疗需求为导向，发展新型的高灵敏度、多模态、智能化纳米探针，为肿瘤的早期诊断、转移预警及疗效预测提供分子影像探针及相关分子影像方法，见图1。具体思路是围绕着恶性肿瘤，尤其是结直肠癌的早期诊断、转移预警以及肿瘤疗效预测这三个肿瘤诊疗所面临的最重要的难题，利用先进的纳米技术，结合化学、分子生物学、肿瘤学、药学及影像学来设计构建高灵敏度多模态肿瘤分子探针，实现尺寸1-3mm结直肠癌的早期诊断（课题1）；构建对肿瘤微环境中特征酶具有智能化响应的分子影像探针，发展肿瘤转移预警的分子影像方法（课题2）；构建对肿瘤微环境中铜锌离子浓度及pH值异常变化的智能化探针，探索上述异常变化与肿瘤发生发展的相关性（课题2）；结合荧光素酶融合再生技术、报告基因技术、核酸适配体分子探针技术，发展结直肠癌信号转导通路的动态可视化方法，为结直肠癌的靶向治疗疗效预测提供实验方法与依据，围绕上皮细胞间质化过程，开展细胞及活体层面的可视化研究，建立结直肠癌早期转移预警的可视化方法（课题3）；建立肿瘤多模态智能化探针的动态可视化平台及多模态影像信息处理方法，在全面评估本课题1－3发展的纳米探针体内行为规律的同时，为结直肠癌的早期诊断、转移预警及疗效预测提供分子影像手段（课题4）。本项目的4个子课题是围绕着肿瘤分子影像探针及影像方法来设置的，课题间既有紧密的内在联系，又有相对的独立性。子课题的研究内容既包括近期能够取得应用的探针体系，又包括占领科学前沿的前瞻性研究。（二）技术途径及其创新性1．高灵敏度多模态肿瘤纳米分子影像探针（1）高质量磁性纳米晶体的制备及表面生物相容性修饰结构的设计窄粒度分布、高结晶度及长血液循环时间的生物相容性磁性纳米颗粒的设计与构建是获得高灵敏度磁共振分子影像探针的核心。本课题拟以前期建立的生物相容性磁性Fe3O4纳米晶体的热分解技术，采用高沸点溶剂作为反应介质，获得窄粒度分布、高结晶度的磁性纳米晶体。而纳米晶体的表面生物相容性结构则通过不同分子量PEG及PEG与烷基小分子对Fe3O4纳米晶体表面的原位共修饰来实现。将采用透射电镜表征所得到的生物相容性磁性纳米颗粒粒度及粒度分布；采用激光动态光散射方法研究生物相容性纳米颗粒在不同介质中的胶体稳定性；通过微量热等手段研究上述各种纳米颗粒与血液中的高丰度蛋白（如：IgG,SA）的相互作用，进一步评价其生物相容性；最后，以实验鼠为模型，静脉注射不同纳米颗粒，测定血液中铁的浓度－时间曲线，建立药代动力学模型计算磁性纳米颗粒的血液半衰期。（2）多模态分子靶向探针的构建肿瘤相关靶点的选择是构建高敏感性分子影像探针的关键，而多模态探针的构筑则是有效提高肿瘤诊断准确率的重要途径。拟采用具有不同生物学意义的肿瘤相关蛋白为靶点，包括：表皮生长因子受体（EGFR）和成纤维细胞激活蛋白FAPa（FibroblastActivationProteina），前者在结直肠癌具有高表达，对于肿瘤诊断具有普适性，后者专一性高表达于肿瘤间质可更好地被用于描绘肿瘤边界，适用于微小肿瘤的早期诊断。采用化学键合的方式通过修饰在磁性纳米颗粒表面PEG末端的羧基与上述靶点相关的抗体进行耦联，获得肿瘤分子影像探针。MR-核素和MR-光学双模探针将采用如下两种策略制备：（1）用放射性核素或荧光染料标记抗体，然后将抗体与磁性纳米颗粒进行耦联；（2）将放射性金属同位素57Co通过化学合成的方法直接内嵌入Fe3O4纳米晶体，再与抗肿瘤抗体共价耦联。57Co掺杂型Fe3O4纳米晶体通过热分解方法制备；EGFR、FAPa抗体与纳米晶体的耦联效率通过电泳结合光谱分析等方法测定；多模态探针的肿瘤亲合性拟通过免疫荧光或放射性免疫竞争法进行评估。相关研究的创新点包括：1•核心纳米材料Fe3O4纳米晶体的制备及其生物相容性调控方法具有创新性；2•以57Co掺杂的Fe3O4纳米晶体构建磁共振-核素双模分子探针具有原创性；3•以FAPa为靶点构建肿瘤早期诊断分子影像探针具有原创性。2．肿瘤微环境智能化纳米分子探针（1）高灵敏度及可定量的铜锌离子及pH探针的构建拟通过分子结构设计，利用特异的分子识别引起的探针荧光信号开关、强度或计量比例的变化实现对金属离子及pH值智能响应探针的构建。针对高灵敏度激活型铜锌离子探针，拟利用构型受限的荧光素或罗丹明衍生物在微量金属离子的作用下发生的开环反应，通过对荧光基团的筛选与结构优化设计，发展发射波长在近红外区域并具有高荧光量子产率的荧光探针；针对比例计量型铜锌离子探针，拟利用荧光共振能量转移或分子内电荷转移原理，将对铜锌离子有高特异性结合力的基团与荧光基团（如呋喃喹啉类发色团）整合到同一分子中,得到有较大Stokes位移（大于100nm）的金属离子比例计量型探针；针对高灵敏度激活型及比例计量型的pH荧光探针，拟利用具有不同pKa的基团在质子化与非质子化状态下对光物理过程的调控，设计具有供体－受体特征的探针；通过分子结构优化使其在pH6.5-7.5区域内的不同临界点产生爆发式突跃的荧光响应或对pH值的改变产生显著的光谱漂移,进而实现灵敏的定性、定量检测。（2）金属离子及pH探针的纳米化结构及生物靶向结构的设计拟采用条件温和的耦联反应将金属离子及pH探针负载在纳米颗粒表面，再通过与肿瘤相关抗体或多肽等靶向分子的耦联，获得可对肿瘤微环境中金属离子或pH产生灵敏响应、且具有靶向性的智能化纳米探针。拟通过在探针分子上引入羧基、氨基或巯基等活性耦联基团，采用发展成熟的酰胺化反应或其它特异性耦联反应实现上述耦联。（3）肿瘤转移预警智能化纳米探针的构建拟通过纳米结构设计，结合MMP-9和FAPa底物的分子结构设计，构筑对肿瘤特征酶MMP-9和FAPa具有选择性响应的纳米智能化探针，实现肿瘤转移预警探针的构建。拟选用包含上述酶特定剪切位点的多肽作为纳米材料的表面修饰材料，通过其桥联作用将荧光染料与纳米材料相连以构建有效的荧光淬灭结构。拟采用常规及时间分辨荧光光谱方法，研究纳米探针载体的染料荧光淬灭效率对作为桥联片段的多肽结构的依赖性。在上述酶存在的条件下，研究智能探针的荧光恢复效率及其对酶检测的灵敏度。最后利用上述探针表面多肽链上的氨基酸残基与肿瘤相关抗体的耦联构建靶向型肿瘤转移预警探针。相关研究内容的创新点：1．以磁性纳米颗粒为载体，通过探针的分子结构设计，针对肿瘤微环境中pH值及金属离子异常变化，构建具有智能化响应的纳米分子影像探针具有重要的原创性；2•针对肿瘤转移相关酶FAPa,通过纳米结构设计，构建对FAPa具有智能化响应特性的分子影像探针具有重要的原创性。3．肿瘤恶性生物学行为重要分子事件的动态可视化（1）与结直肠癌诊疗密切相关的EGFR/VEGFR-小G蛋白信号通路可视化研究方案1:利用荧光素酶报告系统实现小G蛋白表达及活性的可视化。通过分子克隆技术分别构建3对不同的小G蛋白（Ras、RhoA、ARL2）-Lucl、对应的小G蛋白效应分子（Raf、Rock、BART）-Luc2重组质粒，转染进入细胞，在细胞内融合蛋白随着EGFR/VEGFR介导的小G蛋白的活化而相互识别，促使Luc1和Luc2结合，产生活性荧光素酶，诱导底物Luciferin发光，实现小G蛋白相互作用的可视化动态检测。主要技术路线：设计与构建三种分别表达小G蛋白和Luc-1的重组质粒以及三种小G蛋白下游效应分子和Luc-2的重组质粒；磁性氧化铁纳米载体-重组质粒偶联；重组质粒分别共转染入肿瘤细胞株中，加入底物，通过检测荧光素酶的荧光活性，实现动态化监测小G蛋白活性；筛选稳定表达重组质粒的肿瘤细胞株模型，用于小鼠体内移植瘤模型的建立。方案2:以核酸适配体纳米探针实现小G蛋白表达及活性的可视化。纳米探针由磁性纳米载体与核酸适配体构成，载体内化进入细胞后，核酸适配体结合活性小G蛋白，构型发生变化，使内部荧光与淬灭基团间距离增大，导致荧光急剧增强，从而实现小G蛋白表达与活性的可视化。该研究工作还包括识别活性小G蛋白的核酸适配体的筛选与表征鉴定。主要技术路线：表达和纯化小G蛋白及其他结直肠癌相关分子;利用配体进化体外筛选技术（SELEX技术）筛选对靶分子特异性结合的核酸适配体，并进行结构研究与优化；根据荧光共振能量转移原理，构建核酸适配体荧光探针；在此基础上将核酸适配体荧光探针装载于抗体修饰的磁性或其他纳米粒子上，实现结直肠癌细胞的定向输送；进而考察细胞内纳米核酸适配体探针对相关靶分子的识别作用；结合纳米核酸适配体探针的磁响应信号以及对肿瘤相关分子的识别特性探索该探针用于动物体内肿瘤的多模态分析的方法。（2）结直肠癌细胞EMT关键分子的可视化研究本研究拟通过分子克隆技术构建由转录因子Snail调控下表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的报告基因，以磁性纳米颗粒作为载体。通过检测报告基因与EMT相关分子影像学证据，揭示肿瘤细胞复杂的信号网络在EMT发生、发展过程中的变化规律，为早期监测肿瘤转移提供相关分子信息。主要技术路线：设计与构建转录因子Snail调控表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的报告基因；磁性氧化铁纳米载体-重组质粒偶联；重组质粒转染入肿瘤细胞株，运用激光共聚焦、内涵活细胞分析系统ArrayScanHCS系统等仪器可视化观察EGFP蛋白的表达，动态监测EMT关键分子Snail基因的表达情况，揭示与其相关的信号通路的变化规律；运用蛋白印迹、细胞免疫组织化学和流式细胞术等方法检测EMT事件的分子表征物如波形蛋白，E-钙粘素，N-钙粘素，aSMA等，为肿瘤的上皮细胞间质化进程提供分子生物学依据；筛选稳定表达Snail报告基因的肿瘤细胞株模型，用于小鼠体内移植瘤模型的建立。（3）建立结直肠癌恶性生物学行为的在体分子多模态影像方法本研究拟通过分子克隆技术建立稳定转染检测小G蛋白活性的报告基因或Snail调控的荧光素酶报告基因的结直肠癌细胞株；利用内化了磁性纳米颗粒的细胞株，建立小鼠移植瘤模型；利用双模影像学手段直接观察肿瘤的进程，解析小G蛋白与Snail活性变化规律，为监测肿瘤恶性生物学行为建立在体影像学方法。主要技术路线：筛选分别稳定转染Snail-EGFP报告基因和小G蛋白-荧光素酶报告基因重组质粒的人，鼠肿瘤细胞株；建立原位移植结直肠癌小鼠模型，应用分子影像学仪器如小动物成像系统、核磁共振等仪器动态监测观察肿瘤发生发展以及肿瘤转移过程，同时直观检测Snail分子在EMT发生发展过程中的变化；利用RT-PCR、免疫蛋白印迹等方法检测与EMT事件相关的基因，蛋白表达情况。本课题组在小鼠移植性肿瘤模型构建有成熟的工作经验。同时本项研究是与其他课题组协作完成，也是课题研究实施的保证。相关研究内容的创新点：以纳米颗粒为载体构建上述智能化探针的创新性体现在以下两个方面。磁性纳米颗粒载体的选用一方面可以提高上述探针的细胞内化率和稳定性，另一方面可以为后期体内研究提供磁共振造影功能。4．肿瘤纳米分子影像探针在体多模态成像（1）磁性纳米颗粒理化特性与磁弛豫特性的相关性研究采用课题1提供的不同尺寸及表面修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒及肿瘤相关磁共振分子影像探针，分别溶于纯水、生理盐水、生理缓冲液及血清中，并配置成—系列梯度浓度，用7TMR测定其弛豫率等主要物理和磁学参数，研究不同尺寸及不同表面修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒对氢质子弛豫特性的影响规律，为相关探针在肿瘤早期诊断中的定量化应用奠定基础。（2）肿瘤纳米分子影像探针在体分布规律、代谢途径及安全性评估建立稳定可靠的结直肠癌动物模型。分别建立1）早期裸鼠模型（7-14天）：分别用结直肠癌细胞进行BALB/c裸鼠皮下注射、直肠壁注射，建立小鼠皮下移植瘤模型和直肠移植瘤模型；2）后期甲基硝基胍诱导的大鼠直肠癌模型（12-14周）：用甲基硝基胍（MNNG）灌肠诱导雄性Wistar大鼠成瘤，制备大鼠结直肠癌诱导模型；3）结直肠癌转移模型的建立（5-7天）：通过结直肠癌培养细胞的BALB/c裸鼠脾脏包膜下注射，制造BALB/c小鼠结直肠癌肝脏转移模型。将纳米探针从尾静脉注射到模型鼠体内，通过采集实验动物血液、主要器官及排泄物，利用探针的放射性信号或荧光信号，研究纳米探针在实验动物体内的分布规律及代谢途径；采用临床生化分析方法测定动物的心肺功能、肝肾功能、造血功能以及内分泌功能的相关生化指标，评价纳米探针的体内安全性。（3）多模态智能化肿瘤纳米分子影像探针在肿瘤早期诊断及转移诊断中的应用采用动物体表信号标记的方法结合体位定位装置，开展成像空间定位配准；结合时空配准及软件配准对多模态肿瘤分子影像信息开展图像融合、图像解析以及海量分子影像数据的综合分析研究，建立肿瘤早期诊断、转移预警的分子影像方法。主要技术路线：采用多模态分子影像方法对多幅图像间互补信息的处理提高图像的清晰度。将高分辨MR图像与高灵敏的光学成像或高敏感PET图像方法相结合。采用像素级图像融合技术的基本原理和方法，对多模态分子影像获得的图像进行图像去噪、图像配准、图像融合。得到初步的实验数据为后期结果分析提供依据。图像去噪主要用中值滤波方法实现；图像配准采用基于特征点提取的图像配准方法；图像融合技术通过对空间域和变换域的融合算法进行研究和分析;基于小波变换的图像融合算法,通过小波逆变换得到融合图像。通过多模态影像融合后的图像高信息量弥补单模态方法信息量低的不足，从而实现肿瘤的极早期诊断（1-3mm肿瘤）及早期微转移预警，提高肿瘤早期诊断的准确性及灵敏度。相关研究内容创新点：1．磁共振探针量效分析的技术途径具有创新性；2．结合动物体表信号标记及动物体位定位装置开展多模态图像的获取、融合及分析的技术途径具有创新性。（三）取得重大突破的可行性分析尽管肿瘤分子影像目前已经在全世界范围内得到了高度关注，并展示出广阔的应用前景，然而国内外相关研究尚处在起步阶段。本项目以肿瘤的早期诊断、肿瘤相关微环境的高灵敏度探测、肿瘤信号转导通路及肿瘤上皮细胞间质化过程的动态可视化为研究目标，以结直肠癌为研究对象，一方面发展微小肿瘤的早期诊断方法；另一方面开展与肿瘤转移诊断、肿瘤早期转移预警以及靶向治疗疗效预测相关的前瞻性研究，研究工作具有取得重大突破的可行性，原因如下：1．研究目标明确，前期工作基础扎实在肿瘤分子影像探针及微小肿瘤早期诊断方面，本项目组成员已经开展了大量的前期工作，包括：高质量生物相容性磁性纳米晶体的制备、肿瘤纳米分子影像探针的构建及活体肿瘤检测等。同时，在多模态分子影像探针的构建及多模态影像信息处理方面也积累了大量的经验，不仅发表了大批高水平的科研论文，而且获得了系列相关专利。借助本项目组拥有的先进且全面的实验动物影像设备条件，建立结直肠微小肿瘤早期诊断的分子影像方法，取得突破具有可行性。在探测肿瘤微环境中特征蛋白酶、金属离子及pH值异常变化的智能化分子影像探针方面，相关研究内容不仅结合了项目组成员的前期工作基础，也包含了项目组成员经多轮讨论形成的原创性学术思想。研究内容既充分体现了前瞻性，也具有实现突破的可能性。具体研究工作基础包括：在金属离子及pH探针方面不仅有多年的研究工作积累，而且在斑马鱼及小鼠上开展过前期动物实验，已经取得了高水平的科研成果；项目组成员在激活型的Cu离子探针及比例计量型的Zn离子探针方面已有很好的前期工作基础，在pH探针方面也取得了重要突破。在肿瘤及小G蛋白相关信号转导通路方面，项目成员曾在国际上研究Rho家族分子著名的实验室系统地研究了Rho家族分子的调控机制，在Rho家族分子激活因子Dbl分子的研究中提出了Proto-dbl的分子内自我抑制学说，研究成果分别发表在国际分子细胞生物学领域著名杂志Mol.CellBiol.、Mol.Biol.Cell、J.Biol.Chem.上。同时，在Rho家族蛋白与肿瘤关系的研究及Rho家族蛋白小分子靶向药物的研发等方面也取得了重要进展，并发表了大量相关学术论文。在小G蛋白信号转导通路可视化研究内容中所涉及的核酸研究方面，项目组多名成员有相关前期工作基础，并在核酸甲基化、多态性及高灵敏度检测方面取得了国际领先的研究成果；在肿瘤细胞特异性核酸适配体的筛选、结构改造、以及核酸适配体用于肿瘤细胞检测、肿瘤标志物的发现、靶向治疗方面有系统的研究工作，发表了系列高水平研究论文。基于上述前期工作基础，开展小G蛋白相关结直肠癌信号转导通路的可视化研究，取得突破具有可行性。在肿瘤的上皮细胞间质化（EMT）方面，项目组成员已经在模型建立这一难题上取得重大突破，成功地建立了体外、体内EMT模型，并构建了Snail调控报告基因质粒，为本项目相关内容的实施奠定了扎实的前期工作基础，开展相关过程的可视化研究具有取得突破的可行性。2．高水平的研究队伍及合理的学科布局本项目作为高度学科交叉的研究，项目团队由无机化学、有机化学、分析化学、物理化学、光化学、生物化学、肿瘤学、影像学、药学等领域的专家组成，项目参加人员的学科布局合理，也是本项目研究内容得以实施并取得重大突破的关键。同时，项目研究队伍由活跃在第一线的优秀中青年科学家为主，包括5名杰出青年基金获得者，1名总后“科技新星”称号获得者，1名教育部长江特聘教授及3名中科院百人计划入选者。3．实验条件一流本项目依托于1个国家实验室、4个国家重点实验室及多个部门重点实验室，项目参加单位华西医院分子影像中心拥有开展本项目必要的多种动物影像设备，这些独特的优势为本项目取得突破提供了重要保障。课题1：高灵敏度多模态肿瘤纳米分子影像探针承担单位：中国科学院化学研究所南京大学吉林大学课题负责人：高明远主要学术骨干：杨文胜、朱进、陆轻铱、杨春晖经费比例：27%主要研究内容：1．高质量磁性纳米晶体的制备及表面生物相容性修饰结构的设计。相关内容包括：磁性纳米晶体的粒度及其分布控制；PEG分子量、PEG与烷基小分子对Fe3O4纳米晶体表面的共修饰对磁性Fe3O4纳米晶体粒度分布、纳米颗粒与蛋白的相互作用规律以及血液半衰期的影响。2．多模态分子靶向探针的构建。相关研究内容包括：57Co掺杂型Fe3O4纳米晶体的制备与粒度分布控制；肿瘤分子影像探针及多模态探针的肿瘤亲合性及体内分布行为；双模及多模探针在肿瘤分子影像早期诊断中的应用方法。研究目标：制备长血液循环时间的磁性纳米晶体，构建高灵敏度多模态肿瘤纳米分子影像探针，实现结直肠癌微小肿瘤的早期诊断。课题2：肿瘤微环境智能化纳米分子探针承担单位：南京大学中国科学院化学研究所课题负责人：张艳主要学术骨干：郭子建、马会民、江华、何卫江经费比例：25%主要研究内容：1•高灵敏度及可定量的铜、锌等离子及pH探针的构建。相关内容包括：激活型及比例计量型荧光探针的设计合成；探针功能化耦联的活性结构设计；探针的细胞毒性及细胞透膜性研究。2•金属离子及pH探针的纳米化结构及生物靶向结构的设计。相关内容包括：探针及靶向分子与纳米颗粒载体的化学耦联；功能化纳米探针的稳定性、生物相容性及检测应用。3•肿瘤转移预警智能化纳米探针的构建。相关内容包括：肿瘤微环境中与转移相关的蛋白酶底物的分子结构设计；染料在纳米颗粒上的负载及荧光淬灭行为研究；智能化探针在肿瘤转移预警中的应用。研究目标：结合分子结构设计及纳米结构设计构建探测肿瘤微环境中的蛋白酶、铜、锌等离子及pH值异常变化的智能化纳米分子影像探针，发展结直肠癌转移诊断的分子影像方法，同时以安全无创的影像学手段揭示肿瘤微环境中铜锌离子及pH值异常变化与肿瘤发生发展的相关性。课题3：肿瘤恶性生物学行为重要分子事件的动态可视化承担单位：中山大学中国科学院化学研究所长春应用化学研究所课题负责人：杜军主要学术骨干：上官棣华、唐纪琳、孙旭平、刘礼兵经费比例：24%主要研究内容：1•与结直肠癌诊疗密切相关的EGFR/VEGFR-小G蛋白信号通路可视化研究。利用荧光素酶融合再生原理，构建小G蛋白与荧光素酶片段融合蛋白基因；建立以磁性纳米晶为基因载体的细胞转染方法；筛选优化可特异性识别小G蛋白的核酸适配体分子探针；实现小G蛋白表达及活性的可视化。2•结直肠癌细胞EMT关键分子的可视化研究。设计构建转录因子Snail调控表达的报告基因；建立磁性纳米颗粒作为载体的基因转染系统；解析体外Snail转录调控活性。3•建立结直肠癌恶性生物学行为的在体分子多模态影像方法。建立含有磁性纳米颗粒并可稳定表达报告基因的细胞株；建立移植瘤动物模型并开展肿瘤恶性表型在体多模态影像研究。研究目标：结合纳米技术与生物技术构建智能化纳米分子影像探针，实现EGFR/VEGFR-小G蛋白信号转导通路及结直肠癌上皮细胞间质化的动态可视化，一方面为结直肠癌靶向治疗疗效预测提供影像学手段，另一方面为肿瘤早期转移预警提供影像学方法。课题4：肿瘤纳米分子影像探针在体多模态成像承担单位：四川大学长春应用化学研究所课题负责人：郜发宝主要学术骨干：毕锋、王慧、许峰、王振新经费比例：24%主要研究内容：1．磁性纳米颗粒理化特性与磁弛豫特性的相关性研究。相关内容包括：氢质子弛豫特性对磁性纳米晶体的尺寸依赖规律；磁性纳米颗粒表面物理化学特性对其生理条件下聚集行为及磁共振造影性能的影响；定量化揭示以磁性Fe3O4纳米晶体为核心构建的探针在肿瘤诊断中的应用。2•肿瘤纳米分子影像探针在体分布规律、代谢途径及安全性评估。相关内容包括：结合放射性核素及荧光检测技术，建立纳米探针体内分布规律及代谢途径的研究方法；研究上述纳米探针对实验动物心肺功能、肝肾功能、造血功能及内分泌功能等的影响，评价探针的体内安全性。3•多模态智能化肿瘤纳米分子影像探针在肿瘤早期诊断及转移诊断中的应用。相关内容包括：结合图像采集时的定位配准及图像分析时的软件配准，开展多模态肿瘤分子影像信息的获取、图像融合、图像解析以及海量分子影像数据的综合分析研究；利用多模态智能化纳米分子影像探针，建立肿瘤早期诊断、转移预警的分子影像方法。研究目标：建立纳米分子影像探针的在体应用评估方法及应用平台，发展多模态分子影像探针在微小肿瘤早期诊断中的应用方法，发展多模态分子影像信息解析方法。（五）本项目各课题间的有机联系以及与项目预期目标的关系1．本项目的课题设置思路及课题间的内在联系课题1的研究方向是高灵敏度、高敏感性结直肠癌早期诊断分子影像探针的构建及其在微小肿瘤早期诊断中的应用。课题1与其他3个课题紧密联系，为课题2、3提供纳米探针构筑手段，为课题4提供多模态分子影像探针。而课题4将为课题1所构建的探针进行体内评估，并用其建立多模态肿瘤分子影像技术平台，与课题1联合建立微小肿瘤早期诊断的多模态分子影像方法。课题2的研究方向是利用特异化学识别反应，设计对肿瘤微环境中特征蛋白酶、金属离子、pH值的异常变化具有高选择响应的智能化纳米探针。课题2在课题4建立的多模态分子影像平台基础上，研究肿瘤微环境特征性变化与肿瘤发生、发展、转移及疗效预测的内在联系，同时也在智能化纳米探针构建策略上为课题3提供支撑。课题3的研究方向是与肿瘤细胞异常增殖、侵袭、转移和耐药等恶性生物学行为密切相关的EGFR/VEGFR-小G蛋白信号转导通路的可视化，以及与肿瘤早期转移密切相关的结直肠癌上皮细胞间质化（EMT）的动态可视化。课题3也是课题1和课题2的深入和扩展，在细胞内分子层面开展研究的同时，将利用课题4提供的动物影像平台将细胞层面实验拓展到活体动物层面。课题4的研究方向是肿瘤多模态分子影像信息的获取及肿瘤分子影像信息的解析。课题4在为课题1-3所构建的探针提供体内应用评估的同时，建立微小肿瘤早期诊断的分子影像平台，并为相关探针从实验室转向临床应用奠定基础。2．各课题与项目预期科学目标的关系本项目预期科学目标包括两个层面：1．建立结直肠癌微小肿瘤早期诊断的分子影像方法，该目标由课题1与4联合完成；2．构建智能化纳米分子影像探针，发展肿瘤相关微环境的高灵敏度探测方法，建立与结直肠癌密切相关的EGFR/VEGFR-小G蛋白信号转导通路及结直肠癌上皮细胞间质化的可视化方法，从更深层次和新的层面为肿瘤的恶性生物学行为提供相关分子影像信息，该目标由课题2-4联合完成。

四、年度计划研究内容预期目标1.深入研究高质量生物相容性磁1.建立高结晶度、窄粒径分布、尺性Fe3O4纳米颗粒以及Au纳米寸可控的生物相容性磁性纳米颗粒的制备方法；开展具有不同颗粒的制备方法；深入揭示纳米表面修饰结构的Fe3O4以及Au颗粒表面物理性质及化学修饰纳米颗粒在生理条件下的胶体结构对其生理条件下胶体稳定稳定性研究。性的影响规律；在5-15nm范围2.设计、合成对铜、锌等金属离子内得到3种尺寸的磁性纳米颗第灵敏检测的激活型分子探针；研粒，粒径分布小于10%。究探针分子的荧光性质包括荧2.获得2-3种左右荧光量子产率接—光量子产率、荧光寿命等；探针近或高于40%的新型铜、锌等离分子的结构改造，引入功能化耦子荧光探针，建立一种探针分子年联的活性基团，建立及优化探针与纳米颗粒有效连接的化学方分子与纳米颗粒的有效连接方法。法。3.获得可用于检测小G蛋白活性3.初步构建小G蛋白-Lucl、小G或Snail调控报告基因质粒；获蛋白效应分子-Luc2报告基因质得可用于核酸适配体筛选的靶粒考察小G蛋白被激活后其耦蛋白、设计2个可高效PCR扩联的荧光素酶对底物的催化活增的DNA文库；初步筛选针对性；构建Snail启动子调控的荧靶蛋白的核酸适配体。

研究内容预期目标光素酶真核表达质粒，考察该报告基因在肿瘤细胞1间质化中的活性参数；与结直肠癌信号转导相关分子的纯化与固定化QNA或RNA文库的设计与合成，核酸适配体的初步筛选。4.金壳铁核磁纳米粒子的制备；研究氢质子驰豫特性对磁性纳米晶体的尺寸依赖规律；小G蛋白原核生物表达质粒的构建；结直肠癌细胞系分子标志物的鉴定；开展多模态分子影像图像采集标准化及图像融合技术研究。初步建立金壳铁核磁纳米粒子的制备技术；初步获得不同粒径的磁性纳米晶体与成像效果间的量效关系;完成主要小G蛋白的表达及初步纯化；完成5种结直肠癌细胞系分子标志物的表达及活性的鉴定。发表SCI论文15-20篇，申请专禾利1-2项。第年体外评价纳米颗粒，主要包括不同表面修饰的磁性纳米颗粒与血浆中高丰度蛋白的相互作用规律研究，不同尺寸磁性纳米颗粒与巨噬细胞的相互作用研究；初步开展磁性-荧光双功能纳米颗粒材料的制备研究。设计、合成双光子及近红外金属发展受表面修饰及纳米颗粒尺寸调控的免疫逃逸策略；初步建立磁性-荧光双功能纳米颗粒材料的制备方法。获得1-2种近红外金属离子或pH荧光探针，构建1-2种对MMP或FAP有智能化响应的纳米探针。

研究内容预期目标离子荧光探针；研究探针分子的细胞毒性及细胞透膜性；测试探针在细胞及活体水平的成像效果并进一步优化探针分子结构；构筑纳米粒子负载的荧光探针；通过桥连片段的选择，针对MMP或FAP等与肿瘤微环境相关的蛋白酶，构建相应的智能化纳米探针。利用小G蛋白活性及Snail调控报告基因质粒建立并筛选稳定表达的结直肠癌细胞；体外研究荧光纳米粒子与生物大分子之间的静电或疏水相互作用，并研究其生物传感信号机理；研究该纳米粒子作为基因载体的细胞转染方法。将能与肿瘤细胞特异性结合的生物分子（EGFR抗体，磷酸化蛋白质抗体或凝集素等）以及具荧光分子修饰于金壳铁核磁纳获得报告基因稳定表达的结直肠癌细胞株；完善1-2种特异性识别结直肠癌相关分子的核酸适配体。建立纳米粒子表面生物修饰的耦联技术；建立稳定f3o4标记细胞的裸鼠皮下及直肠移植瘤模型；初步获得不同表面修饰的磁性纳米晶体与成像效果间的量效关系；建立诱导性结直肠癌动物模型标准化方法。发表SCI文章20-25篇，申请专利3-5项。

研究内容预期目标米粒子表面；f3o4纳米颗粒标记细胞的裸鼠皮下及直肠移植瘤模型的建立；磁性纳米颗粒表面不同物化特性对其造影效果的影响；药物诱导的大鼠直肠癌模型和小鼠结直肠癌肝脏转移模型的建立；与课题三合作，筛选出出2-3种小G蛋白核酸适配体并进行初步鉴定。1.开展纳米颗粒与肿瘤靶向分子1.建立纳米颗粒的生物耦联方法；的耦联研究；开展57CO掺杂型获得窄粒度分布的磁性-放射性Fe3O4双功能纳米晶体的制备研双功能纳米颗粒；得到血液循环究；在活体动物水平评价不同表时间长于10小时的磁性纳米晶第面修饰以及不同尺寸的纳米颗体。三粒对其血液半衰期及其体内分2.制备2-4种具有较大Stokes位移布的影响规律研究。的比例计量型荧光探针；实现年2.设计、合成具有较大Stokes位移nM级的铜、锌等离子的灵敏检的比例计量型荧光探针；优化荧测。光探针与磁性纳米颗粒的缀合3.获得1-2种与结直肠癌相关信号方法；研究染料在纳米颗粒上的通路分子具有相互作用的纳米-负载及荧光淬灭行为；研究功能核酸适配体探针，完成结构表征

研究内容预期目标化纳米探针的稳定性、生物相容性。解析小G蛋白信号通路活性的体外变化规律；解析Snail活化状态与EMT发生的相关性；在单细胞水平上表征纳米-核酸适配体探针的稳定性、内化效率以及对结直肠癌细胞的形态和超微结构的影响。以基于磁性氧化铁纳米晶体分子影像探针为研究对象，开究其在体单模态成像效果的量效关系；体外评价生物耦联后的多模态荧光-金磁纳米探针在生理环境中的稳定性及细胞毒性；结合放射性核素及荧光检测技术，开究纳米探针在体内分布特征及血液半衰期测定；采用临床生化分析方法测定动物的心肺功能、肝肾功能、造血功能以及内分泌功能的相关生化指标。与优化。通过系统的动物体内外实验，尤选1-3种有应用价值的纳米分子影像探针；筛选优化出1-3种生理环境中稳定细胞毒性低的多模态探针；对纳米探针的体内安全性进行早期评估。发表SCI论文20-25篇，申请专利2-4项。

研究内容预期目标1.开展以EGFR、VEGFR以及1.获得MR-核素和MR-光学双模FAPa为靶分子的MR-核素和分子影像探针，得到适合结直肠MR-光学双模探针的构筑研究；癌早期诊断用单模态及多模态开展肿瘤分子影像探针及多模分子影像探针。态探针的肿瘤亲合性及体内分2.构建1-2种对肿瘤微环境特殊标布行为研究。志物有智能化响应的纳米探针。2.利用已构建出的探针分子，对肿3.获得可靠、稳定的小鼠结直肠癌瘤微环境中的异常金属离子浓动物模型；获得能对结直肠癌细第度及pH进行检测；针对探针纳胞中靶分子特异性响应的纳米米化的需求，对探针分子结构的探针；四进一步优化；通过探针分子与靶4.通过系统的动物体内外实验，尤向分子的连