2020年07药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向参照模板课件

药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向2023/9/81常艳国家上海新药安全评价研究中心药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向2023/8/31常艳1药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌性评价的概要3传统和替代致癌试验的研究434主要内容药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌2

遗传毒性评价的指导原则

SFDA-中国国家食品药品监督管理局

ICH-人用药物注册技术规定国际协调组织

OECD-经济合作发展组织

EMEA-欧洲药品评价局

USFDA-美国药监局

USEPA-美国环境保护署

MHLW-日本厚生劳动省其他世界性的政府法规部门

药物研发监管的主要药政实体

遗传毒性评价的指导原则

药物研发监管的主要药政实体3OECD、EPA可供参考的遗传毒性指导原则

遗传毒性试验的指导原则

OECD、EPA可供参考的遗传毒性指导原则

遗传毒性试验的指4SFDA

体外：2项试验

•细菌回复突变试验（Ames）——Required

•染色体畸变试验（CA）

OR

•小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验（MLA）

体内：1项试验

•微核试验（MN）——Required

《药物遗传毒性研究技术指导原则》ZHGPT2-1,2007等同于ICHS2BSFDA《药物遗传毒性研究技术指导原则》ZHGPT2-5ICH

S2A+S2BICHS2A+S2B6FDA-RedbookRedbook2000:IV.C.1Short-TermTestsforGeneticToxicityJuly2007Redbook2000:IV.C.1.aBacterialReverseMutationTest

Redbook2000:IV.C.1.bInvitroMammalianChromosomalAberrationTestRedbook2000:IV.C.1.cMouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssayRedbook2000:IV.C.1.dMammalianErythrocyteMicronucleusTestFDA-RedbookRedbook2000:IV.C.7FDA-CDERFDA-CDER8FDA-CDERFDA-CDER9EMEAEMEA10EMEAEMEA11EMEAEMEA12Step2Step1Step3Step42006200720082009~2011

2006.06ICHSC同意启动修订工作

2006.10ICHEWG讨论筹划修订方法

2007.05对修订内容达成一致意见，开始起草S2(R1)

2007.10完成起草的S2(R1)

2008.02签署S2(R1)，完成step2

2008.06审议意见，回答公共注释

2008.11未按期开会（未获得彗星试验数据）

2009.06

体内试验单次和重复给药方案都接受

FDA对取消体外细胞试验或降低最高浓度和细胞毒性提出异议

2011.11S2(R1)正式颁布遗传毒性标准组合试验的修订2009~2011Step2Step1Step3Step420062013ICHS2A+S2B=S2(R1)S2R1的修订宗旨：减少体外哺乳动物细胞试验的假阳性动物试验3R原则（替代、减少和优化）Invivo：

建议整合入重复给药毒性实验中每次实验不必使用平行的阳性对照应用流式细胞仪检测ICHS2A+S2B=S2(R1)S2R1的修订宗旨：I14ICHS2A+S2B=S2(R1)ICHS2A+S2B=S2(R1)15遗传毒性标准组合试验的修订S2BS2R1选择一选择二细菌回复突变试验（withrepeat）细菌回复突变试验（Norepeat）细菌回复突变试验（Norepeat）体外哺乳动物细胞试验：CA/MLA10mMCellgrowth:50%/RTG:

80%体外哺乳动物细胞试验：CA/MLA/MN

1mM

≤50%/

≥80%无体外哺乳动物细胞试验体内微核试验（单独一项且是急性毒性试验）体内微核试验（整合至一般毒理试验中）一项体内微核试验+一项体内不同检测终点/组织试验（肝Comet试验）（整合至一般毒理试验中或联合在同一个试验）遗传毒性标准组合试验的修订S2BS2R1选择一选择二细菌回复16整合试验的最高剂量和暴露整合试验的最高剂量和暴露17ICHS2(R1)修订小结

S2A和S2B整合入一个指导原则中；

提供可选择的遗传毒性试验组合；减少体外哺乳动物细胞试验不相关的阳性；

体内遗传毒性试验可以整合入重复给药毒性试验中；

无需每一项体内试验都设同步的阳性对照；体外细菌突变试验无需重复试验。ICHS2(R1)修订小结S2A和S2B整合入一个指导原18ICHS2(R1)

PfuhlerS.etal.2009ICHS2(R1)PfuhlerS.etal.219药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌性评价的概要3传统和替代致癌试验的研究434主要内容药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌20遗传毒性传统试验方法31细菌回复突变试验（Ames试验）人工诱变的突变株在组/色氨酸操纵子中有一个突变，突变的菌株必须依赖外源性组/色氨酸才能生长，而在无组/色氨酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组/色氨酸的培养基上也能生长。野生型（原养型）突变型（缺陷型）遗传毒性传统试验方法31细菌回复突变试验（Ames试验）人工21Ames试验测试系统：细菌鼠伤寒沙门氏菌：组氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌：色氨酸营养缺陷型菌株特性鉴定Ames试验测试系统：细菌22菌株组/色氨酸突变缺失可检测的突变类型修复LPSVIT质粒TA1535G46urvB-rfa-

bio----碱基置换TA1537C3076urvB-rfa-bio----移码TA97D6610urvB-rfa-bio-pKM101移码TA98D3052urvB-rfa-bio-pKM101移码TA100G46urvB-rfa-bio-pKM101碱基置换TA102G428urvB+rfa-bio-pKM101碱基置换WP2uvrAtrypEuvrA---pKM101碱基置换Ames试验菌株组/色氨酸突变缺失可检测的修复LPSVIT质粒TA1523Ames试验Ames试验24浓度设置阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少五个剂量组；阳性对照组；Ames试验浓度设置阴性对照组/溶剂对照组；Ames试验25方法平板掺入法：-0.1mL受试菌液；-0.1mL受试物、溶剂对照或阳性物溶液；-0.5mL磷酸钠缓冲液/S9混合液；-2.0mL融溶的顶层琼脂（0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素

和0.05mML－组胺酸）

混合后，铺于底层琼脂上，室温凝固。Ames试验方法平板掺入法：Ames试验26预培养法-将下列物质在冰浴上混合：

0.5mLS9混合液或0.5mL磷酸缓冲液

0.1mL过夜培养菌液（大约10^8菌量）

0.01mL受试物溶液（或对照，溶剂和阳性对照物溶液）

-将该混合液在37℃下培养20分钟（水浴中）-然后加入2mL含有0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－

组胺酸的融溶顶层培养基，铺至基础培养琼脂表面（V-B培养基E），在

室温下凝固。

Ames试验预培养法Ames试验27代谢活化系统大鼠肝S9混合液S9制备方法：取5只雄性大鼠，处死大鼠的前5天单次腹腔注射给予500mg/kg的Aroclor1254。处死，放血，无菌取肝组织，匀浆，经9000g离心10分钟后的上清液部分为S9。将S9分装成2-4mL/管，冷冻保存在-70℃～-85℃。

Ames试验代谢活化系统大鼠肝S9混合液Ames试验28结果观察和判定计数突变菌落数－致突变性观察背景菌斑－毒性判断是否具有致突变性Ames试验结果观察和判定计数突变菌落数－致突变性Ames试验29假设的证明无组氨酸的VB平皿7个克隆来自0对照平皿

划线7个克隆来自1000ug/皿处理组划线全部生长:克隆为组氨酸回复突变克隆无生长：克隆不是组氨酸回复突变克隆Ames试验—案例1假设的证明无组氨酸的VB平皿7个克隆来自0对照平皿7个克隆来30测试系统哺乳动物细胞：CHL,CHO

人外周血淋巴细胞细胞核型遗传毒性试验的技术要点32染色体畸变试验(CA)测试系统遗传毒性试验的技术要点32染色体畸变试验(CA)31剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少三个剂量组；阳性对照组；染色体畸变试验剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；染色体畸变试验32方法细胞复苏、培养；受试物处理；加入秋水仙素，使细胞停止于分裂中期；收获细胞，滴片空气干燥，染色染色体畸变试验方法细胞复苏、培养；染色体畸变试验33包括代谢活化和非代谢活化条件在处理后6和24小时收获细胞代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时染色体畸变试验处理条件包括代谢活化和非代谢活化条件染色体畸变试验处理条件34读片分析有丝分裂指数－毒性染色体结构畸变染色体数目畸变染色体畸变试验读片分析有丝分裂指数－毒性染色体畸变试验35试验系统小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-细胞既能够检测点突变，也能够检测出大的染色体损伤自发突变率高，需要定期清除自发突变。33小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）遗传毒性传统试验方法试验系统33小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）遗传毒性传统试验方法36ThymidineKinase(TK):233aminoacidsCodedbytheautosomaltkgenetkgene:Situatedatthedistalendoftheq-armofchromosome11(mouse)orchromosome17(human)Sizeoftkgene:11kbwith5intronstklocusmutation:tk+tk-allelecausedbyTGtransversionatposition489小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）基本原理ThymidineKinase(TK):233am37Targetcell：MouselymphomaL5178Ytk

+/-3.7.2Ccellline(D.Clive&P.Voytek.MutatRes,1977)L5178Y-3cellline（tk

+/+）EMStreatmentL5178Y-3.7.2cellline（tk

+/-）L5178Y-3.7cellline（tk

-/-）Spontaneousreversemutation(selectedbyTHMGmedium)MLA基本原理Targetcell：MouselymphomaL5138TK+/-cells(TFTsensitive&THMGresistant)TK-/-cells(TFTresistant&THMGsensitive)Mutagentreatment

TK+/-cells(L5178Y,TK6,WTK1)treatedbychemicals,andthenselectedbyTFT(trifluorothymidine)Thegrowingcolony—TFTresistant(TK-/-)mutantMLA基本原理TK+/-cells(TFTsensitive&39培养基不含马血清的RPMI1640培养基含10%马血清的RPMI1640培养基含20%马血清的RPMI1640培养基小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）培养基不含马血清的RPMI1640培养基小鼠淋巴瘤细胞试验（40受试物处理时间

TK基因突变试验中，要使用短时处理(3～4小时)方式。但张立实和Honma等的研究表明，使用长时间(24或48小时)处理可显著提高MLA对某些染色体断裂剂和纺锤体毒物的检出率。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）受试物处理时间TK基因突变试验中，要使用短时处理(341突变选择剂

在MLA中最初使用5-溴脱氧尿苷（BUdR）作为突变选择剂，后来改用三氟胸苷（TFT）。二者均为胸苷类似物，都能被胸苷激酶磷酸化，其磷酸化产物掺入DNA可导致tk+/-细胞死亡。但TFT的作用比BUdR更迅速，TFT在一个细胞世代即可阻滞tk+/-细胞，因此TFT选择平板背景清晰；而BUdR则需要经历数个细胞世代才能完全阻滞tk+/-细胞，故可产生分散的微小集落（microcolony），形成特征性的背景阴影（backgroundhaze）。因此，现TFT已基本取代了BUdR，成为TK基因突变试验的常规选择剂。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）突变选择剂在MLA中最初使用5-溴脱氧尿苷（BUd42基本方法软琼脂平皿法（softagarmethod）在美国使用较多。在平皿中生长的抗性突变细胞集落呈近似正态分布，根据实验结果可计算克隆效率（cloningefficiency，CE）和突变率（mutationfrequency，MF）等指标。微孔平板（microwellmethod）（即96孔培养板）法在欧洲使用较多。在微孔中生长的抗性突变细胞集落呈Poisson分布，根据实验结果可计算接种效率（platingefficiency，PE）和突变率等指标。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）基本方法软琼脂平皿法（softagarmethod）在美43CellsExpression(2d)Chemicaltreatment(3hor24h)PlatingforPE0PlatingforPE2PlatingforTFTrIncubation(12d)ColonycountingandcalculationIncubation(12d)小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）CellsExpression(2d)Chemicalt44突变集落在TK基因突变试验中，经过TFT选择后长出的抗性细胞集落（即tk-/-突变体）可分为两种类型，即大集落（λ集落）和小集落（σ集落）。微孔平板法：大集落≥微孔直径的1/4

小集落＜微孔直径的1/4软琼脂平皿法：大集落直径≥0.6mm

小集落直径＜0.6mm大集落呈弥散性生长，其密度低；小集落呈集中性生长，其密度高。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）突变集落在TK基因突变试验中，经过TFT选择后长出的抗性细胞45

一般认为大、小集落突变体是由于基因损伤的范围和程度不同所致。大集落突变体的基因损伤多仅局限于

tk位点（即小范围的点突变）；而小集落突变体是由较大范围的染色体改变（染色体断裂、缺失、重组或分离异常等）所致。这是TK基因突变试验能够检出基因突变和染色体畸变两类终点，并能在一定程度上对二者加以区分的重要机理。但关于两类集落产生的确切机制及其意义，还有待进一步的研究。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）46小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）试验结果的判定

各处理组的MF值呈浓度依赖性升高，判定为阳性；MF值≥阴性对照值+126，判定为阳性。（微孔法中的GEF=99+27=126）阳性对照参考值其一，阳性对照组总诱导率IMF至少≥300×10-6，其中小克隆IMF至少≥120×10-6其二，小克隆IMF至少≥150×10-6满足上述标准之一，并且阳性对照相对总生长率（RTG）

≥10%结果评判小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）试验结果的判定阳性对照参考值结47原标准组合中唯一一项体内试验采用大鼠或小鼠（6～10周）分析骨髓中嗜多染红细胞中的微核，嗜多染红细胞是红细胞成熟的一个阶段，主核已排出，容易观察微核遗传毒性试验的技术要点34体内微核试验原标准组合中唯一一项体内试验遗传毒性试验的技术要点34体内微48微核形成体内微核试验微核形成体内微核试验49剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少三个剂量组；阳性对照组；（S2R1建议无需每次试验均设阳性对照）体内微核试验剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；体内微核试验50试验方法给药－临床拟用途径；预试验中测定时相点，确定正式试验的采样时间；收集骨髓细胞，离心，涂片，干燥，固定，染色体内微核试验试验方法给药－临床拟用途径；体内微核试验51读片计数PCE/NCE的比例－反映毒性计数含微核PCE的细胞百分率；体内微核试验读片计数PCE/NCE的比例－反映毒性体内微核试验52S2R1推荐的试验方法测试系统

哺乳动物细胞：CHL,CHO,V79胞质分裂组织剂——松胞素B（Cyt-B）

通过阻止微丝聚合而破坏胞质分裂所需的微丝环，从而达到阻滞胞浆分裂又不影响胞核分裂的目的。体外双核微核S2R1推荐的试验方法测试系统体外双核微核53浓度设置阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少三个浓度组阳性对照组；体外双核微核试验浓度设置阴性对照组/溶剂对照组；体外双核微核试验54方法细胞复苏、培养；受试物处理；收获细胞，滴片空气干燥，染色(+CytB)(+CytB)体外双核微核试验方法细胞复苏、培养；(+CytB)(+CytB)体外双核微核55读片分析胞浆分裂阻断增值指数（CBPI）－细胞毒性双核微核率（1000～2000个双核）体外双核微核试验读片分析胞浆分裂阻断增值指数（CBPI）－细胞毒性体外双核56给药染毒采集血样（～100l）－80℃至少固定3d离心(300g,10min,4℃)buffer洗脱孵育标记FCM检测4℃,30minRT/37℃,30minS2R1推荐的试验方法FCM体内微核自动化检测给药染毒采集血样（～100l）－80℃至少固定3d离心(357FCM体内微核自动化检测甲醇（99.8%）－80℃至少固定3dAnti-CD71-FITCAnti-CD61-PEPIRNase生物标准品—伯氏疟原虫感染的红细胞模仿MN调节PMT电压调节补偿血样固定标记染色质控FCM体内微核自动化检测甲醇（99.8%）Anti-CD7158FCM体内微核自动化检测图1利用CD71-(-)样品和疟原虫生物标准品建立FCM检测小鼠外周血MN的模板。

FCM体内微核自动化检测图1利用CD71-(-)样品和疟原59ABCDFCM与常规显微镜检MN结果相关性良好，同时获得3个指标：%RET、%MN-RET和%MN-NCE；

染色体断裂剂和非整倍体诱导剂都能检测出来；

重复性好，同样的受试物剂量在本实验室和其他已知报道的实验室结果相当；

排除一些假阳性因素的干扰:使用RNase，排除聚集RNA的干扰；使用CD61抗体，排除血小板的干扰；使用CD71抗体特异标记RET，排除常规Giemsa同染的嗜碱性小体等干扰。

三色FCM自动化MN检测系统符合IWGT的标准FCM体内微核自动化检测ABCDFCM与常规显微镜检MN结果相关性良好，同时获得3个60基本满足分子生物学和组合化学的大量候选化合物的毒性筛选

快速、高通量灵敏、客观机制研究无种属选择性三色FCMvs

显微镜检既可以检出染色体断裂剂，也可以检出非整倍体诱导剂；研究量效关系和毒性阈值。啮齿类骨髓和外周血；其他骨髓样品不易获取且脾脏亦有消除MN-RBC作用的物种的MN检测（狗、灵长类等）FCM亦能得出MN大小和分布的资料，即PI相关的荧光数值的大小（如DNA含量）

FCM体内微核自动化检测基本满足分子生物学和组合化学的大量候选化合物的毒性筛选快速61S2R1推荐的试验方法体内Comet试验S2R1推荐的试验方法体内Comet试验62体内Comet试验体内Comet试验63遗传毒性新方法的研究遗传毒性新方法的研究64体内Pig-a基因突变试验Pig-a是N—乙酰葡萄糖胺转移酶复合体催化亚基的编码基因，N—乙酰葡萄糖胺转移酶催化细胞表面磷脂酰肌醇聚糖（glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚的早期合成，GPI锚可将一些特殊的蛋白（如CD55、CD48等）连接到细胞表面。pig-a突变导致细胞表面GPI锚蛋白缺陷。在与GPI锚合成有关的基因中，只有pig-a位于X染色体上，其他基因都位于常染色体上，故GPI锚缺陷表型几乎等同于pig-a突变。基本原理体内Pig-a基因突变试验Pig-a是N—乙酰葡萄糖胺转移酶65体内Pig-a基因突变试验体内Pig-a基因突变试验66体内Pig-a基因突变试验体内Pig-a基因突变试验67体内Pig-a基因突变试验体内Pig-a基因突变试验68药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌性评价的概要3传统和替代致癌试验的研究434主要内容药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌69药物致癌性评价的概要药物致癌性试验的指导原则2.ICH指导原则

-S1A：药物致癌试验的必要性-S1B：药物致癌试验

-S1C：药物只要试验的剂量选择

-S1C(R)：药物致癌试验剂量选择的附件1.SFDA指导原则（国食药监注[2010]129号）

-《药物致癌试验必要性的技术指导原则》<Technicalguidanceontheneedforcarcinogenicitystudiesforpharmaceuticals>

（等同于ICHS1A）药物致癌性评价的概要药物致癌性试验的指导原则2.ICH指70药物致癌性评价的概要致癌性试验指南药物致癌性评价的概要致癌性试验指南71药物致癌性评价的概要ICHS1A和SFDA指导原则致癌试验要求

-持续使用6个月以上的药物或频繁、周期性、间歇性使用的药物；

-如果有致癌倾向，一些短期使用药物也要做致癌试验，

-某些剂型或输药系统会导致体内药物长期暴露的

时间窗要求

-批准上市之前要做致癌试验；

-一些特殊关注的群体（如婴幼儿）则需要在批准（IV期临床）前做

-用于严重甚至威胁生命的疾病的药物可以在临床批准（IV期临床）后做（没满意的可替代疗法；特定人群如肿瘤病人较短的生存期；视适应症不同等情况而定）药物致癌性评价的概要ICHS1A和SFDA指导原则致癌72药物致癌性评价的概要

以下情况不需要致癌试验

-明确的基因型致癌物

-假定此类药物具有跨种属致癌性

-经眼睛用药和皮肤用药

-药物无明显的结构警示和全身暴露-药物经过盐、酸或某些治疗性基因改变

-改变之前的试验数据已存在

-改变后的PK、PD和毒性没有明显改变

-用于治疗危及生命的疾病或患者存活期较短（＜2-3年）

生物制剂（蛋白疗法）通常不要求致癌试验—casebycase（ICHS6）

ICHS1A和SFDA指导原则药物致癌性评价的概要以下情况不需要致癌试验ICHS1A73遗传毒性和致癌性的相关性基因型与非基因型致癌物的致癌性

-Ames阳性的致突变剂中，80%具有致癌性

-由2年动物致癌试验证实呈阳性的致癌物中，50%具有遗传毒性Correlationisnotperfect!2.药物体外遗传毒性试验的阳性率偏高(Snyderetal.–MutatRes.2001,488:151-69)

-25%上市药物具有遗传毒性结果

-在体外染色体损伤试验中证实阳性的药物，在致癌试验中大部分呈阴性

-在体外染色体损伤试验中，高于治疗浓度的药物呈阳性，通常与细胞毒性有关3.药物的遗传毒性和致癌性不完全相符的其他原因

-

体内组织修复功能

-适应性反应

-遗传多态性

-器官及系统之间相互作用等因素遗传毒性和致癌性的相关性基因型与非基因型致癌物的致癌性Co74遗传毒性和致癌性的相关性遗传毒性和致癌性的相关性75药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌性评价的概要3传统和替代致癌性试验的研究434主要内容药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌76致癌性试验研究先导物研发靶点筛选候选物筛选I期临床III期临床II期临床IV期临床传统两年啮齿类动物致癌试验

-起始于上世纪60年代，首先用于检测工业化学物质的致癌性

-现用于检测大多数慢性药物的致癌性非传统啮齿类动物致癌试验–转基因动物

-1997年开始用于检测新药的致癌性（ICHS1B）

-目前尚未用于首要和工业化合物的致癌性检测GLP致癌性研究大鼠小鼠致癌性试验研究先导物研发靶点筛选候选物筛选I期临床III期77传统两年致癌性试验

啮齿类每个品系都有其病变背景并容易自发肿瘤，因此背景数据和经验非常重要。大鼠-因为SD大鼠的死亡率高，所以每组动物数量要多（70只/性别/组）

-Wistar和F344大鼠存活率高些，但F344渐渐不受欢迎

-Wistar大鼠用的越来越多，50只/性别/组小鼠

-CD-1和B3C6F1在两年致癌性试验中较常用

种属和品系的选择传统两年致癌性试验种属和品系的选择78传统两年致癌性试验

1个溶剂对照组，3个给药组至少50只/性别/组，可考虑增加（如：70只/性别/组）-中期处死

-毒代样品采集

-其他血样采集

-两年存活率低（终身试验）计划给药104周

理想情况下，在计划处死时能有25只/性别/组以计划用于临床的给药方式给药；环境化学品、人用食品添加剂或动物饲料补充剂等加入饮食中。

组数和每组动物数传统两年致癌性试验组数和每组动物数79传统两年致癌性试验

104周大鼠口服给药致癌实验*若赋形剂不常用，可增加一个对照组；因为有中期剖检和毒代用动物数量增加

Note：根据ICH指导原则，对于长期用药，6个月毒理试验加一个两年致癌性试验足够了，无需12个月的毒理试验。同时，需要用主实验的动物或独立的TK组动物进行TK实验进行评估。基本的实验设计组别剂量（mg/kg）动物中期剖检毒代1对照组*064M/64F10M/10F4M/4F2低剂量组X64M/64F10M/10F4M/4F3中剂量组Y64M/64F10M/10F4M/4F4高剂量组Z64M/64F10M/10F4M/4F传统两年致癌性试验基本的实验设计组别剂量（mg/kg）动物中80传统两年致癌性试验

“最高剂量或最大耐受剂量用来预测在致癌性试验过程中会产生的最低毒性作用”-ICHS1C(R2)在最高推荐人用剂量时，啮齿类与人类血清AUC（无毒药物）的暴露比大于25:1吸收饱和—最大暴露限制剂量药理学—镇静，食欲不振，血压过低，影响实验数据的癫痫如果以下情况发生，采用限制剂量（药物）：1500mg/kg

-人用剂量<500mg/d；无遗传毒性；暴露水平高于最高推荐人用剂量的10倍

最大可行剂量

-饲料量的5%；最大灌胃量；局部耐受性高剂量的选择传统两年致癌性试验高剂量的选择81传统两年致癌性试验

展示不同剂量组药物代谢动力学、药理学、毒理和致癌性范围—各组间暴露不同很重要展示不产生毒性或未出现药物相关肿瘤的剂量水平（定义阈值）通常使用给药剂量或人类暴露的几何或线性倍数通常低剂量接近临床暴露水平低剂量和中剂量的选择传统两年致癌性试验低剂量和中剂量的选择82传统两年致癌性试验

对于药品，FDA的CAC特别提出了一套评估方案，包括给药原理和实验设计客户必须提交与实验计划给药途径一致的预试验结果，此外还需提交遗传毒理学数据，人类给药和暴露剂量，蛋白结合信息，人体和动物中代谢物的数据在试验开始前，无任何其他机构定期审查方案如果FDA与客户意见一致或客户同意接受美国FDA的建议，无论研究结果如何，FDA都认为剂量的选择适当美国FDA致癌评估委员会（CAC）传统两年致癌性试验美国FDA致癌评估委员会（CAC）83传统两年致癌性试验毒理学监测-摄食量

-体重

-临床症状

-六个月后进行触诊肿块，一般每周一次，但可以低于此频率。每周触诊可以对肿瘤的发病提供更好的评估对濒死的动物实行安乐死，早期处死要比晚期死亡更有价值预先设定好安乐死标准将加速决策进程活体数据采集传统两年致癌性试验活体数据采集84传统两年致癌性试验

每个实验中药物的暴露情况都必须进行评估在实验中第6-12个月对暴露情况评估一次就足够了通常取3-4个时间点，每个剂量组每个时间点取3-4只动物进行如果用主实验的动物，每只大鼠取一个样品；对于小鼠用卫星动物组收集和分析对照组的样品期望有独立的毒代动力学报告

毒代动力学传统两年致癌性试验毒代动力学85传统两年致癌性试验

医药品通常不进行临床病理的检验，除非有项目特殊要求（STP,inpress2010）实验终期进行临床病理检测没有价值，而中期处死时进行却很有价值如果在实验早期没有将临床病理检查定义好，在15个月内也可以考虑进行特定的检查血涂片和骨髓涂片是否要进行常规采集？

-可以作为保险措施

-通常不进行

-根据情况而定临床病理学传统两年致癌性试验临床病理学86传统两年致癌性试验

在全面评价潜在致癌性研究时统计学是一个重要的工具控制假阳性错误-对罕见肿瘤P<0.05

-对常见肿瘤P<0.01专题负责人必须监测活体阶段所有初步假设的统计因素，并减少偏离

对死亡率、肿块、大体和组织病理学数据的评估是十分复杂的*来自活体阶段人员以及病理专家的数据要准确完整

-足够的死亡率（到80~90周时尚有50%）

-早期处死濒死动物以保存组织

-跟踪活体阶段表明肿瘤

-确定可能的死亡原因*见指导原则《药物慢性啮齿类致癌试验的设计，分析和阐释中的统计学》,FDACDER,2001统计分析应考虑的因素传统两年致癌性试验统计分析应考虑的因素87传统两年致癌性试验

每层架子上的各组动物数目相等定期在房间内交替架子，以减少视网膜退变在非工作时间，采用低光照以减少视网膜退变给药顺序：对照组，低剂量组，中剂量组，高剂量组；避免交叉污染以同样顺序来采集毒代样品高标准的动物管理是至关重要的保持同样的饲料/垫料来源，密切监测成分/污染物的变化

活体期间动物的饲养与管理传统两年致癌性试验活体期间动物的饲养与管理88传统两年致癌性试验

如果死亡率很高，可能一个剂量组全部早期处死更合适

FDA在通讯中提到：-在第100周以前，幸存动物数降至15时，可考虑处死该给药组或该性别所有动物

-在某些方案中，当幸存动物数降至20时，停止对高剂量组该性别动物的给药；当幸存动物降至15时，处死高剂量组受影响的性别的所有动物

-如果对照组的幸存动物数下降至20或更少时，处死所有剂量组中受影响的性别的所有动物

-在100周以后，如果高剂量组的幸存动物降至15时，处死所有剂量组中受影响的性别的所有动物

-早期处死一个剂量组不会实验无效剂量组的提前终止传统两年致癌性试验剂量组的提前终止89传统两年致癌性试验

早期处死与早期死亡-所有组织采集

-早期处死动物比发现死亡动物更有价值大鼠品系的选择会影响动物的寿命和到计划处死时存活的比例

-Wistar大鼠存活率比SD大鼠高肿块跟踪-跟踪活体阶段的每一个肿块

-与解剖结果的关联

-通过显微评价来跟踪解剖时发现的肿块（Peto试验要求）解剖传统两年致癌性试验解剖90传统两年致癌性试验

检查方案中各组所有动物的所有组织和肿块跟踪解剖中发现的所有肿块的显微诊断尽可能将大体观察与显微观察结果关联起来；但是“大体观察与显微观察没有关联”也是可接受的，不是每个大体观察都有相关联的显微观察，重要的是你所观察到的。如果可行的话，确认肿瘤的原发部位将肿瘤归类为“致命”与“非致命”：-有没有可能是肿瘤促成的动物提前死亡或死亡

-要求专业判断

-要求做Peto试验

-计划处死的动物不需要记录计划处死前解剖的动物死亡或濒死的原因显微评价传统两年致癌性试验显微评价91传统两年致癌性试验

致癌性实验是评价化合物在动物体内潜在致癌性的特定的非临床安全性评价，旨在增进人类的潜在致癌风险评价

致癌性试验开展时间取决于药物的类型和关注程度

-通常在临床试验第二，三阶段进行，很少在第IV阶段（上市后）进行

-通常104周的生物评价采用大鼠或小鼠进行

-使用转基因动物或敏感的体外试验来推进致癌性试验一些药物可能不需要进行致癌性试验

-细胞毒性抗癌药物一般不需要进行致癌性试验-生物技术药物也可除外（ICHS6）专题负责人、毒理人员和统计人员作为一个团队，共同设计、执行和评估-选择种属应考虑药代、毒代情况

-实验中每组必须有足够的动物，试验设计或执行使偏离最小化

-剂量选择是关键，必须显示暴露范围，从推荐人用剂量到MTD或最大可行剂量

-活体阶段，死亡、解剖和显微数据必须衔接

-对数据全面评价的统计方法必须适当总结传统两年致癌性试验总结92替代致癌性试验ICHS1B潜在致癌性研究的指南1997年：1个两年性致癌试验+1个替代模型的体内试验

Trp53+/-（应用于遗传毒性的药物）

rasH2（应用于遗传毒性和非遗传毒性的药物）

Tg.AC（局部采用，许多阳性结果，遗传不稳定）

XPA-/-和XPA-/-xp53+/-新生鼠

开始启动（Ito模型）p53+/-转基因小鼠替代致癌性试验ICHS1B潜在致癌性研究的指南p53+/93替代致癌性试验应用替代模型的原因减少动物使用并降低费用两年致癌试验的问题被广泛认知—肝细胞肿瘤；许多发现与人不相关提供有助于风险评估的其他信息如有时间要求，可以缩短至9个月可以延长试验直至III期结果显示成功阳性结果的几率降低rasH2转基因小鼠替代致癌性试验应用替代模型