荧光传感微球材料的研究现状与展望

荧光传感微球材料的研究现状与展望

尽管广相广相广播仪的应用灵活，并且具有很高的灵敏度和选择性，因此受到人们的高度重视。然而，广相广播仪的缺点也限制了其应用，因为很难完全组件化，只能一次性使用，并且容易污染试验系统。另一方面，荧光薄膜传感器和荧光微球传感器基本上克服了这些缺点，近年来引起了人们的广泛关注。例如，reinhoudt等人、蝙蝠、swag等人、模型等人和其他工作围绕着荧光膜传感器进行了大量工作，并取得了令人兴奋的成果。然而，由于透射性和基本单元效应，溶液中使用的广受欢迎微球传感器的灵敏度一般不高，这限制了实际应用。与固体微球相比，微-纳米级微球的表面更大。作为广观传感器的载体，它可以有效地提高传感器分子的固定量，改善传感器材料的渗透性，显著提高传感器的灵敏度。此外，当以超顺磁性微球为载体时，这些传感器可以很容易地分离、重复使用，这不仅使人们重视膜广观传感器的研究，而且非常重视微球传感器的研究。正如膜传感器一样，微球传感器通常以小分枝作为传感器活动的分子，这主要是因为荧光方法具有高度的渗透性，并且可以收集信息（如荧光强度、荧光光谱形状、各向异性、荧光寿命等）。考虑到荧光微传感器的研究重要性，本文简要介绍了阐明微球传感器的研究进展情况。1荧光传感微球由于二氧化硅微球制备方法简单,价格低廉,易于表面修饰,使其成为理想的微球传感器支撑材料.Lin等以MCM-41型介孔SiO2微球为基质,用邻苯二甲醛对其巯基化表面进行修饰生成OPTA(o-phthalichemithioacetal),利用OPTA与含氨基化合物反应后生成具有强荧光的异吲哚这一性质,合成了该类化合物的传感微球材料M1(图1).实验发现,M1对多巴胺的响应速度比对氨基葡萄糖的响应速度快至少10倍,利用这一动力学差异可以分别测定生物活性分子多巴胺和氨基葡萄糖.值得注意的是,多巴胺分子和氨基葡萄糖分子大小相近,在均相溶液中与OPTA的反应活性也基本相同,因此,这种响应差异可能不是来自于载体孔道的屏蔽作用,而是由于含有大量羟基的氨基葡萄糖与Ml内壁羟基的强偶极作用抑制了其在载体孔道中的扩散速度,因此M1对其响应较慢.多巴胺和谷氨酸是两种必不可少的神经递质,在生命过程中发挥着重要的作用,由于两者在神经细胞中同时存在,难以对其分别测定.Lin等以聚乳酸(PLA)包覆传感微球M1(参见图1),合成了能够区分细胞外多巴胺和谷氨酸的传感微球.实验表明:多巴胺可以快速穿过PLA层并与OPTA反应,产生较强的荧光信号,而谷氨酸和酪氨酸等难以通过PLA层,与OPTA反应困难,荧光增敏现象出现较慢.在这一区分测定过程中,PLA膜层发挥了“门卫”作用(gate-keepingeffect).他们将这种“门卫”作用归因于PLA与谷氨酸和酪氨酸等之间较强的相互作用,这种作用的存在也得到了以裸露M1所进行的对比实验的证明.Tan等设计合成了一种能检测牛肉沫中大肠杆菌的SiO2纳米传感微球.他们将荧光染料钌联吡啶(RuBpy)掺杂在SiO2纳米颗粒中,然后将能与大肠杆菌表面抗原特异作用的抗体化学结合在其表面,通过观察体系荧光变化就可以检测大肠杆菌.这种微球传感器利用信号放大效应克服了传统细菌扩增法耗时费力的缺点,使得大肠杆菌的检测变得简单易行.在这种方法中,一个细菌可以结合数千个纳米颗粒,而一个纳米颗粒又可以携带数千个荧光活性分子,这样信号可以成千上万倍地扩大.除了这些优点之外,在微球传感器表面还可以同时结合多种抗体,使得多种细菌的同时检测成为可能.虽然利用荧光增强作用对蛋白质进行定量测定已经成为蛋白定量的通用方法,但这种方法存在的光漂白和信号弱等缺点一直未能很好解决.以半胱氨酸修饰纳米ZnS颗粒可以得到水溶性复合ZnS微球材料,该荧光微球可以用作蛋白质的检测探针.以同步扫描技术(Δλ=190nm)进行蛋白质检测,发现蛋白质存在时,体系在267nm处出现强荧光,利用这一信号可以实现蛋白质的灵敏检测.除此之外,该法还具有检测无毒、检测信号稳定、检测范围宽等优点.相对于荧光增敏,猝灭型荧光微球传感器使用得更多.多年来,MIT的Swager等一直致力于微痕量硝基芳烃类化合物的荧光检测,他们合成了一系列类似于图2所示的共轭荧光聚合物,据称这类荧光聚合物具有分子导线或“一点接触,多点响应”效应,因此荧光量子产率高,对猝灭剂存在敏感,用其加工制备的传感器优点突出.以这类共轭荧光聚合物为活性成分的薄膜传感器或微球传感器的传感性能与待检测物质在涂层中的通透性关系极大,因此在设计合成这类聚合物时要在其侧链上连接大基团,防止主链相互聚集,在涂层中形成分子通道,提高相关传感器的传感特性.例如,将这种聚合物沉积在能吸附溶液或土壤中硝基芳烃类化合物的聚合物微球上,得到能够探测微痕量硝基芳烃类化合物的荧光传感微球材料,这类微球被称之为“智能沙子”(smartsand)(图3).王柯敏等也利用分子导线聚合物的信号放大效应,根据氰离子加入前后聚合物荧光发射强度的变化较好地实现了对氰离子的选择性检测.多巴胺在中枢神经系统的信息传递方面扮演十分重要的角色,它的浓度与帕金森、神经分裂等重要疾病密切关联,因此对其精确检测意义重大.Raymo等报道了一种多巴胺的快速可靠荧光探针检测法,他们用硅烷化试剂预先处理SiO2微球,然后使其与荧光活性阳离子2,7-二氮杂芘的衍生物结合,得到了一种荧光传感微球材料(图4),缺电子的荧光分子与富电子的多巴胺分子结合导致微球荧光急剧猝灭,从而显示多巴胺的存在.Rosenzweig等将光泽精(一种能够特异识别卤素离子的荧光染料分子)标记的磷脂膜共价固定于聚苯乙烯微球表面,制备了氯离子荧光传感微球材料,利用此荧光传感微球可以在线检测人体血液中氯离子浓度.Kopelman等将一种荧光素衍生物共价结合于金胶体颗粒表面,制备了对NO特异传感的荧光微球材料.NO的吸附使得荧光素在微球表面的取向发生变化,从而微球荧光强度降低,据此可以测定白鼠巨噬细胞内的NO含量.光诱导电子转移(photo-inducedelectrontransfer,PET)是一种重要的光物理过程,也是荧光猝灭的一种特殊形式.将PET过程用于传感微球设计,可以进一步丰富荧光传感微球的设计思路.Ayadim等用末端为氨基的硅烷化试剂处理SiO2微球,然后将其再与氯甲基蒽反应,得到一种对pH敏感的荧光微球材料.当该微球处于酸性环境中时,因质子化封闭了连接臂N原子上的孤对电子,使得导致荧光猝灭的PET过程无法发生,体系荧光增强.相反,在碱性环境中,N原子上孤对电子可以参与PET过程,使体系荧光猝灭.这样根据体系荧光强度的变化就可以实现pH的测定.更为有趣的是,当将蒽以较高密度固定到微球表面时,微球对溶液pH变化不再敏感,而对有机溶剂中微量水的存在却异常敏感,利用这一现象可以实现非水体系中痕量水的半定量测定.王辉等利用溶胶-凝胶法制得了纳米SiO2微球,利用表面反应将萘化学固定于微球表面(如图5),发展了一种超灵敏铜离子荧光微球传感器.综上所述,基于微球的荧光强度变化的荧光传感器具有原理简单、现象易于观察等优点,在实际工作中易于应用.但对许多复杂体系而言,这类荧光微球传感器因抗干扰能力弱而难以应用,因此,出现了比例型荧光微球传感器.2荧光传感微球传感器Montalti等将丹磺酰共价结合于SiO2微球表面(图6),以微酸性溶液处理所得微球,得到表面结合丹磺酰部分质子化的微球材料.实验发现,质子化的丹磺酰光物理行为与未质子化的丹磺酰很不相同,两者可以被选择性地激发.实验还发现,因参与能量转移和电子转移,这两种形态之间可以发生相互作用.质子化强烈猝灭丹磺酰修饰SiO2微球的两种荧光发射,这一过程与溶剂极性关系极为密切,据此可以对微球微环境极性进行灵敏检测.作者预期这一发现将在设计制备新型荧光传感材料方面获得应用.Bakker等将荧光手段与阴离子-质子共萃取机理相结合,设计制备了以塑化聚氯乙烯微球为载体,尼罗兰衍生物(ETH5294,图7)为传感元素的两类对特定离子具有选择性识别能力的荧光传感微球材料.在第一类微球材料中,微球表面只有尼罗兰ETH5294.利用质子化ETH5294及其非质子化ETH5294发射光谱位置的差异,依靠两个荧光发射相对强度的变化可以实现对某些阴离子的选择性识别.该微球对阴离子的选择性取决于被萃取阴离子的水合焓.在第二类微球材料中,微球表面除了化学结合ETH5294外,还担载有能够特异识别钾离子、钠离子和铅离子等的离子载体,从而实现对多种金属阳离子的选择性识别.以这些荧光传感微球为检测试剂,结合流动细胞技术可以对细胞中有关离子进行快速分析.Cai等制备了温度响应型荧光微球传感器.这种荧光传感微球的化学本质是铒掺杂氟化玻璃微球,这种微球具有上转换荧光性质.其中位于522和546nm的荧光分别来自铒的4S3/2和2H1/2激发态.以两者强度比值为参量,可以在150—850K范围内对温度进行比较精确的测定,分辨率可达lK.相对于其他玻璃或光纤温度传感器,这种微球温度传感器具有容易制备、成本低、测量简单、结果可靠等优点,如果调整微球尺寸,还可以进一步扩展微球的温度测量范围.Rotello等将2,6-二(N-乙酰胺基)吡啶和芘同时共价结合于金胶体颗粒表面,实现了对核黄素的选择性识别.2,6-二(N-乙酰胺基)吡啶有多个氢键结合位点,可以和核黄素形成氢键,而芘与核黄素可以发生π-π相互作用,这两种作用的存在使得胶体金颗粒表面对核黄素具有特异结合能力(图8).除上述单荧光物种标记传感微球外,将两种荧光物种同时标记于微球表面,利用被检测物质加入前后两者荧光发射相对强度的变化,也可以实现对待测组分的检测.由Kopelman等提出的生物定位包埋探针(probeencapsulatedbybiologicallylocalizedembedding,PEBBLE)技术备受人们重视,这种技术的核心是用荧光染料对纳米颗粒进行标记,根据荧光染料与被测物质结合前后荧光强度等的变化来检测被测物质的存在.利用这种技术可以测定单个细胞的pH、细胞内外钙离子浓度等.除此之外,这种技术还具有选择性高、可逆性好、响应时间短等优点.在此基础上,Kopelnan等还设计制备了对活细胞内镁离子选择性传感的荧光微球传感器,其中标记所用荧光试剂为香豆素343和Texas红.选择香豆素343的原因在于其可以选择性结合镁离子,而Texas红仅被用作参考荧光物质.实验表明,钙离子、钠离子、钾离子等的存在均不干扰测定.与自由态荧光相比较,微球荧光基本不受非特异性吸附蛋白的影响.此外,这种荧光微球传感器表面还可以键合诸如配体、特异蛋白、DNA等多种生物分子,这样根据测定对象可以选择合适的生物分子对其表面实施修饰,得到对特定生物物质敏感的荧光传感微球.不难看出,这类荧光微球传感器在生物医学检测,特别是在单个活细胞生物医学检测中将获得重要应用,显示出很好的应用前景.巨噬细胞对病毒或细菌的吞噬作用是机体对外来感染的免疫应答.吞噬作用发生后细胞会分泌溶菌酶、胶原酶、酸性水解酶等,溶菌酶的pH值可作为其活性标志,同时亦表现出吞噬细胞的活性.Rossenzweig等将pH敏感染料Oregon绿和非pH敏感染料Texas红共价结合到带有大量氨基的亚微米聚苯乙烯微球表面,制备了对白鼠巨噬细胞内溶菌酶的pH敏感的荧光传感微球,利用这种微球研究了氯喹对细胞内溶菌酶分泌的影响.实验发现,随pH升高,Oregon绿与Texas红的荧光强度比值增大,利用这一比值作为参量实施测定较之单用Oregon绿要好得多,可以有效补偿仪器漂移、传感器位置移动以及其他因素所引起的测定误差.此类荧光传感微球的缺点在于荧光试剂暴露于测试环境中,易于受到干扰.当氯喹浓度达到100μmol/L以后,测定结果出现较大偏差.为此,Rosenzweig等将荧光素和四甲基罗丹明双标记的磷脂共价结合于带有大量羧基的聚苯乙烯微球表面,制得了对溶菌酶pH敏感的新的荧光微球材料.在这一材料中,四甲基罗丹明为参考荧光物质,荧光素则为对pH敏感的荧光试剂,微球的pH响应范围为5.5—7,最小分辨率可达0.1个pH单位.由于许多蛋白质分子的直径、细胞膜的厚度和多亚基蛋白质位点间的距离多在2—6nm之间,与荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的特征Frster距离相近,因此FRET技术在生物物理研究中获得了广泛应用.Rosenzweig等利用FRET技术和碳水化合物对凝集素分子的特异选择性结合实现了对碳水化合物及糖蛋白的传感.具体过程是将荧光素标记外源凝集素分子吸附在聚苯乙烯微球表面作为给体,以Texas红标记葡聚糖分子为受体,当体系中存在碳水化合物或糖蛋白时,其与外源凝集素分子结合,占据葡聚糖分子的结合位点,导致FRET效率降低.根据碳水化合物与糖蛋白结合能力的不同,可以定量区分这两类物质在溶液中的浓度.Steemers等利用FRET原理设计了一种分子信标,并将其连接到光纤阵列断面(图9),用于检测特定寡核苷酸序列.在这种分子信标的末端连接着荧光物种F,另一端连接有猝灭剂分子Q,连接臂则为一段具有特定序列的寡核苷酸,连接臂内部的寡核苷酸通过配对形成发夹结构,当没有目标DNA分子时,F与Q相互靠近,F的荧光被猝灭,体系无荧光信号或荧光信号很弱;当出现目标分子时,发夹结构展开,F与Q相对远离,体系发出荧光.很显然,与强度变化型荧光微球传感器不同,比例型荧光微球传感器是以两种荧光物种的荧光强度之比或同一荧光物种的两个不同荧光发射的强度之比作为参量进行检测,这样不仅可以减小测定误差,增加测量的准确性,而且可以有效避开环境因素干扰,拓宽微球类荧光传感器的实际应用.3光纤传感微球将荧光传感微球分散于待测溶液中,根据微球荧光信号的变化检测待分析物是最常用的荧光传感微球使用方法.例如,Swager等研制的“智能沙子”就以这种方法获得应用.然而,如果不解决荧光微球传感器的重复使用问题,它就很难获得实际应用.基于这一考虑,人们提出以超顺磁性微球作为荧光活性物质载体制备荧光传感微球.例如,Qiu等以包覆有苯乙烯和马来酸酐共聚物的超顺磁性Fe3O4/邻苯二甲酸铕荧光微球为载体,将肝磷脂共价结合在其表面,不但解决了传感微球的分离和重复使用问题,而且还提高了微球的生物相容性,扩展了传感微球的使用范围.除了以上述途径解决荧光传感微球的分离和重复使用问题外,通过集成化,也可以解决这一问题.事实上,集成化还可以使此类荧光传感微球更加易于器件化和仪器化.将光纤作为微球材料集成化的载体,可以实现对特定成分的远距离传感.Walt等利用光纤将具有不同传感性能的微球材料集成化,依靠荧光成像技术实现了对样品中多组分的同时检测.他们将纤维末端浸于HF溶液中,利用光纤芯和包皮材料对HF反应的不同在光纤断面上形成微井(microwell),然后将已经预先功能化的微球随机置于微井中,组装成具有如图10所示的具有特殊结构的光纤荧光微球传感器.很显然,这种光纤荧光微球传感器的充分使用有赖于对不同类型荧光传感微球的有效识别,以使荧光测量系统能够辨别它们.为了实现对不同传感微球的编码,通常以菁染料DiIC(indodicarbocyanine)和Texas红染料TRC(Texasredcadaverine)对相关微球进行双标记,这是由于两者可同时被577nm光源激发,并在670和610nm处形成各自的最大发射峰.这样,以不同比例的DiIC和TRC标记不同种类传感微球,就可以达到对这些微球进行编码识别的目的.以双标记微球为载体,对其表面进行修饰就可以得到对不同待分析物敏感的荧光传感微球材料.以这些传感微球为检测材料,利用特殊的检测仪器或系统就可以实现对样品中多种成分的同时测定.事实上,利用活细胞对pH,O2以及CO2敏感的性质设计制备的光纤荧光微球传感器已经成功用于对细胞新陈代谢过程的检测,这种检测具有快速、可重复和非侵害性等特点.实际