小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量测定

小柴胡颗粒中柴胡皂苷的含量测定

“小柴胡”于2005年在中国经典药物版中公布，但与柴胡质量控制方法不足。小柴胡方为和解剂的代表方,而柴胡和解表里、疏肝升阳,是小柴胡方的君药;就“小柴胡颗粒”而言,柴胡的用量最大,已接近其他各单味药用量的3倍。因此可以说柴胡是小柴胡颗粒中最为重要的组分。所以控制小柴胡颗粒中柴胡成分的含量对于控制小柴胡颗粒的质量最有实际意义。柴胡主含挥发油、皂苷类成分,特别是皂苷类成分,2005年版中国药典“柴胡”项下已作为药材理化鉴别的主要依据之一。根据“小柴胡颗粒”的制剂工艺可知,“小柴胡颗粒”没有刻意保留挥发油的工艺条件,这与《伤寒论》中“小柴胡汤”的制法相吻合,符合遵古制作指导思想,因而制剂中柴胡挥发油类成分保留较少,成品中可以不予考虑。但柴胡皂苷类成分在制剂工艺中得到了充分提取,成品中也应得到充分体现。因此制剂中以柴胡皂苷类成分作为柴胡的质量控制指标具有一定的合理性。然而,在柴胡皂苷类成分中,其主成分柴胡皂苷a和d因其分子中环氧结构的不稳定性导致在制剂工艺过程中大量转化,以致一些制剂成品中已经不能检出此两皂苷。另就“小柴胡颗粒”的现行提取工艺而言,尚无可靠手段完全防止或有效控制柴胡皂苷a和d的转化速度和程度。从而在客观上造成了“小柴胡颗粒”制剂中某1种或2种柴胡皂苷含量的不确定性。所以,在柴胡制剂中仅测定某1种柴胡皂苷的含量对其质量控制意义不大。这也是目前众多柴胡制剂中没有柴胡皂苷定量控制方法的主要原因之一。研究结果已经阐明,柴胡皂苷a和d分子中的环氧键断裂后,分别转化为柴胡皂苷b1和b2,在没有药理研究结果能够证明哪种柴胡皂苷就是小柴胡颗粒的有效成分之前,我们探索性地把柴胡制剂中的几种主要柴胡皂苷成分的总和作为制剂中柴胡的质量控制指标。本文采用薄层扫描法同时测定小柴胡颗粒中柴胡皂苷a(d)、b2(b1)的含量,方法简单快速,能耗低,专属性强,结果可靠。并以四者之和作为含量评价指标,对市售商品“小柴胡颗粒”的质量状况进行比较,具有较强的针对性。为小柴胡颗粒中的柴胡皂苷含量评价方法提供一点方法思路和试验依据。1仪器、设备和分析方法CamagTLCScanner3型薄层扫描仪、CamagLinomat5半自动点样仪:瑞士卡玛;BP211D型电子天平:北京赛多利斯仪器公司;高效硅胶G薄层板:天津思利达色谱技术有限公司;离心机(500~4000r·min-1);HH-S数显恒温水浴锅;KQ2200B型超声波清洗器。柴胡皂苷a(110777-200406,供含量测定用):中国药品生物制品检定所,柴胡皂苷b2:自提,含量96%。小柴胡颗粒:市售商品。柴胡饮片:购于北京同仁堂药房,经鉴定,符合药典标准。试剂均为分析纯。2溶液的制备2.1混合对照品溶液分别精密称取经40℃、五氧化二磷、真空干燥处理12h的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2各6~7mg,置同一10mL量瓶中,并加甲醇定容至刻度,摇匀,即得每1mL含柴胡皂苷a、b2各0.6~0.7mg的混合对照品溶液。2.2正丁醇萃取液配制精密称取小柴胡颗粒3g,置事先装有3mL水的具塞离心管中,振摇使溶解。加正丁醇3mL,振摇萃取10min,离心(2000r·min-1)3min,吸取上层正丁醇萃取液,另存备用。下层液继续用正丁醇如法萃取3次,合并正丁醇萃取液,用氢氧化钠试液洗涤2次,每次2mL,离心(2000r·min-1)3min,分取下层氢氧化钠洗液(上层正丁醇溶液备用),合并,用正丁醇5mL振摇萃取10min,离心(2000r·min-1)3min,吸取正丁醇溶液,并与前面正丁醇溶液合并,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。2.3阴性样品溶液的制备按中国药典2005年版“小柴胡颗粒”项下【处方】的1/10量备料,按【制法】项下方法制成不含柴胡的小柴胡颗粒阴性样品粉末(未制粒),并按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。2.4柴胡溶液2.4.1黑胡椒干浸膏称取柴胡饮片适量,按照“小柴胡颗粒”制备的方法制备成柴胡干浸膏。取柴胡干浸膏适量,按照供试品溶液的制备方法制备成柴胡饮片溶液(煎煮,0.1g·mL-1)。2.4.2胡椒饮片甲醇提取溶液0.1gml-1称取柴胡饮片1g,置于15mL的具塞试管中,加入甲醇10mL,超声(100W,40kHz)提取30min,离心(2000r·min-1)3min,吸取上清液至10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得柴胡饮片甲醇提取溶液(0.1g·mL-1)。3%对二甲氨基苯甲醛的溶液高效硅胶G薄层板;展开剂:三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1);展距:8~9cm;展开后热风吹干。显色剂:2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液;显色方法:把薄层板浸入显色剂0.5s后,取出,沥干多余的显色剂,于烘箱中60°C加热5min,立即用干净的2块玻璃(20mm×10mm)夹封,并用胶带将其固定。薄层扫描条件:单波长吸收扫描,λ=538nm,光束狭缝6.0mm×0.45mm,测定供试品吸光度积分值和对照品吸光度积分值。4供试品色谱参数吸取供试品溶液10μL,按照上述薄层色谱条件试验,以仪器给出各峰特征参数(Rf值)进行计算,供试品色谱中,柴胡皂苷a(d)与柴胡皂苷b2(b1)分离度为1.21,符合中国药典规定(图1-B)。5提取法见表1分别吸取供试品溶液、阴性样品溶液、柴胡皂苷混合对照品溶液各10μL;柴胡饮片溶液(煎煮提取)、柴胡饮片溶液(超声提取)各5μL点于同1张薄层板上,如法展开、显色、扫描。结果显示阴性样品溶液色谱中分别在柴胡皂苷a、b2相应的位置上未见干扰吸收(见图1-C)。6同一硅胶g薄层板上,4.3.4%,5.2,4.43精密吸取柴胡皂苷混合对照品溶液1mL于10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度。分别精密吸取0.4,0.8,1.6,3.2,6.4μL依次点于同一硅胶G薄层板上,展开,显色,扫描。结果显示在点样低于0.8μL时柴胡皂苷a色谱峰不能获得积分值,在点样低于1.6μL时柴胡皂苷b2色谱峰不能获得积分值,因而柴胡皂苷a、b2的最低检出量分别为52,106ng。7标准曲线的绘制精密吸取柴胡皂苷混合对照品溶液2,4,6,8,10μL点于同一薄层板上,每量2点,依量循环点样,展开,显色,扫描测定。以点样量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果各得1条直线。柴胡皂苷a、b2的回归方程分别为:Y=2.23×103X+5.2×102r=0.996Y=2.80×103X+7.7×102r=0.999线性范围分别为1.30~6.50μg,1.32~6.61μg。因为柴胡皂苷a和b2的线性回归方程皆不经过原点,故在含量测定时采用外标二点法。8精密度测试8.1柴胡皂苷检测取同一供试品溶液在同一薄层板上点样6个点,每点10μL,如法展开,显色,扫描测定,得柴胡皂苷a(d)、柴胡皂苷b2(b1)峰面积的RSD分别为1.2%,0.43%。8.2空液回收的柴胡皂苷检测取同一供试品溶液在不同的6块薄层板上各点2个点,每点10μL,如法展开,显色,扫描测定,取每板扫描结果的均值,计算得柴胡皂苷a(d)、柴胡皂苷b2(b1)峰面积的RSD分别为2.2%,1.6%。9稳定性试验9.1薄层显色稳定性吸取供试品溶液点于薄层板上,如法展开、显色后,薄层板立即用洁净玻璃夹封并用胶带固定好后立即置扫描仪中扫描测定。并在第1次扫描测定后,每隔10min重复扫描测定含量1次,结果表明在1h内薄层显色稳定,柴胡皂苷a(d)的RSD=1.4%;柴胡皂苷b2(b1)的RSD=2.4%。9.2柴胡皂苷ad、bb及其他a/d的量测取新制备的供试品溶液点于薄层板上,如法展开,显色,扫描测定。之后每隔8h重复点样、展开、显色、扫描,测定柴胡皂苷a(d)、b2(b1)的含量1次,结果表明在48h内供试品溶液稳定,柴胡皂苷a(d)的RSD=2.6%;柴胡皂苷b2(b1)的RSD=3.8%。10苷ad的含量精密称取同一批号的小柴胡颗粒,按照“2.2”项下方法制备成供试品溶液,平行操作6份,分别依法测定含量,柴胡皂苷a(d)的含量分别为0.142,0.154,0.149,0.161,0.145,0.151mg·g-1,平均值为0.150mg·g-1,RSD为3.3%。柴胡皂苷b2(b1)的含量分别为0.153,0.145,0.164,0.161,0.151,0.158mg·g-1,平均值为0.155mg·g-1,RSD为3.6%。11对照品溶液的制备取已知柴胡皂苷含量的小柴胡颗粒1.5g,共6份,精密称定后加入适量的柴胡皂苷对照品溶液。按照供试品溶液的制备方法制备得加样回收试验溶液,如法测定含量。结果见表1。12供试品溶液及检测分别精密吸取供试品溶液10μL、混合对照品溶液2及10μL,交叉点于同一薄层板上,各点2点。如法展开、显色、扫描,按各皂苷峰面积的平均值计算供试品中各柴胡皂苷的含量。结果见表2。13气相色谱质谱分析13.1柴胡皂苷的含量测定方法有薄层扫描法、HPLC法、HPLC-ELSD法等,这些方法见报的多为单组分测定或柴胡药材中柴胡皂苷含量的测定。用HPLC法测定复方制剂中柴胡皂苷的含量时,由于柴胡皂苷仅有末端吸收,且干扰成分与柴胡皂苷很难达到基线分离,影响测定结果的准确性。本研究用薄层扫描法同时测定柴胡皂苷a和d、b1和b2含量,杂质干扰小,皂苷间分离度较好。本方法操作快速简便,且对仪器要求不高,其薄层色谱图可用作小柴胡颗粒中柴胡皂苷快速鉴别的依据。13.2柴胡皂苷a和d互为异构体,具有解热、抗病毒、抗炎、降血脂、护肝等生理活性。柴胡皂苷b1和b2由柴胡皂苷a和d转化而来。本方法选择的展开剂,可使柴胡皂苷a和d、b1和b2在色谱中分别重叠为1个斑点(见图1),即柴胡皂苷a和d形成1个斑点、b1和b2形成1个斑点,且2个斑点分离良好,这样可用柴胡皂苷a、b2对照品为对照,同时测定柴胡皂苷a和d、b1和b2的含量,方法简单,省时低耗。但实际制剂中柴胡皂苷a和d、b1和b2的比例是不确定的,当对照品只使用其中1种时,由于柴胡皂苷a和d、柴胡皂苷b1和b2对各自色谱的贡献可能不尽相同,因此测定误差在理论上仍然存在。本方法测得柴胡皂苷a和d的总量应是以柴胡皂苷a计的量[表示为:柴胡皂苷a(d)],柴胡皂苷b1和b2的总量应是以柴胡皂苷b2计的量[表示为:柴胡皂苷b2(b1)]。13.3对2个对照品