炎症性肠病与炎症小体的研究进展

炎症性肠病与炎症小体的研究进展

感染性肠病（ibd）是一种非特异性肠炎（cs），包括溃疡性胃炎（tc）和克罗恩病（cd）。结肠炎相关癌变(colitis-associatedcancer,CAC)是IBD的主要并发症之一,IBD及其癌变的发生机制与遗传易感个体肠道黏膜免疫系统与肠道抗原之间的相互作用密切相关。作为宿主的第一道防线,先天免疫感受各种病原体及其产物和内源性损伤信号主要依赖于一类被称为炎症小体(inflammasomes)的多蛋白复合体。研究显示炎症小体活化异常与多种人类先天性和获得性炎症性疾病有关,在维持肠道内稳态以及肠道癌变过程中发挥重要作用。本文就炎症小体与IBD及其癌变关系的研究进展作一综述。一、蛋白结构域和分子中蛋白的相关分子炎症小体是由胞质内PRRs参与构成的一类多蛋白复合体,可在病原体感染或应激如细胞损伤、代谢异常条件下被激活,调控caspase-1活性,触发促炎细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)成熟,参与先天免疫防御。胞质内的PRRs主要包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-bindingoligomerizationdomain-likereceptors,NOD-likereceptors,NLRs)、造血组织干扰素诱导核蛋白-200(hematopoieticinterferon-induciblenuclearproteinwiththe200-amino-acidrepeat,HIN-200)等。其中NLRs分子有三种基本结构域:①C端富含亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)结构域,负责探测和识别配体;②中央NACHT结构域,负责NLRs的寡聚化和活化;③N端一个热蛋白结构域(pyrindomain,PYD)或1～2个caspase募集结构域(caspaserecruitmentdomain,CARD),负责与下游接头蛋白和效应分子结合。HIN-200类分子结构具有高度相似性,N端有一个PYD结构域,C端至少有一个由200个氨基酸残基组成的重复序列,故又称P200蛋白。这些PRRs在识别病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)或内源性损伤相关分子模式(damage-associatedmolecularpatterns,DAMPs)后,发生自身寡聚化,再通过同源结构域之间的相互作用,如PYD、CARD等募集接头蛋白ASC和caspase-1前体(pro-caspase-1),组装成多蛋白复合体。复合体形成后,pro-caspase-1的CARD结构域自我切除,形成P10/P20异二聚体,两个异二聚体结合形成(P10/P20)2四聚体,即有活性的caspase-1。活化的caspase-1剪切IL-1β前体和IL-18前体,使之成为成熟的IL-1β和IL-18,以非经典的蛋白分泌方式分泌至胞外。以NLRP3炎症小体为例,其含有NLRP3蛋白、ASC和pro-caspase-1;在接受刺激后,NLRP3通过PYD-PYD同源结构域的相互作用募集ASC,ASC通过CARD-CARD同源结构域的相互作用募集pro-caspase-1,最终形成能诱导pro-caspase-1自身剪切,形成活化型caspase-1的多蛋白复合体——NLRP3炎症小体。二、炎症小体及aim2蛋白表达目前已鉴定出5种炎症小体,分别为NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、AIM2炎症小体,NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6属于NLRs家族成员,AIM2属于HIN-200家族成员。1.nlrp3炎症小体的激活NLRP3炎症小体是目前研究最为深入的一种炎症小体,可被多种病原体及其成分或产物激活,如金黄色葡萄球菌、李斯特菌、白色念珠菌、酿酒酵母菌、仙台病毒、细菌RNA、尼日利亚菌素等;内源性损伤信号或环境致病因子,如胞外ATP、尿酸钠晶体、二氧化硅、紫外线等亦可激活NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体活化物众多、彼此间结构差异大,目前共有四种活化机制假说:①K+外流:由ATP依赖的嘌呤受体P2X7R活化或细菌毒素介导的膜孔道形成,导致K+外流或膜通透性增加,最终使NLRP3炎症小体活化。②组织蛋白酶B释放:大分子物质如二氧化硅等被吞噬进入胞内后,形成吞噬溶酶体并导致其酸化,组织蛋白酶B被释放至胞质中,激活NLRP3炎症小体。③活性氧簇(ROS)产生:多数NLRP3活化物可致胞内ROS增加,ROS能使硫氧还蛋白结合蛋白自硫氧还蛋白上分离,与NLRP3的LRR结构域结合,激活NLRP3炎症小体。但最近研究发现ROS抑制剂的作用可能是阻断NLRP3炎症小体的启动(NLRP3转录)而非阻断其活化。④线粒体损伤和功能失调:线粒体是细胞内ROS的主要来源,抑制自噬可致受损、产ROS的线粒体积聚,抑制线粒体呼吸链亦可致ROS产生,这些均可引起NLRP3炎症小体活化,而抑制线粒体膜上的电压依赖性阴离子通道以抑制线粒体活性,或使用线粒体ROS特异性清除剂Mito-TEMPO,可使NLRP3炎症小体的活化明显受抑。然而上述任何一种活化机制假说均无法完美解释NLRP3炎症小体的活化过程,推测这些机制相互之间可能并不排斥,而是共同存在于激活过程中,其间的关系有待进一步研究。2.spe-pcr扩增nlrc4炎症小体细菌鞭毛蛋白是肠道先天免疫的主要活化物。NLRC4又称鞭毛蛋白受体,其N端为CARD结构域,故ASC并非NLRC4炎症小体活化所必需。沙门菌、军团菌、铜绿假单胞菌等的鞭毛蛋白可通过细菌的Ⅲ型或Ⅳ型分泌系统进入胞质内,被神经元凋亡抑制蛋白5(neuronalapoptosisinhibitoryprotein5,NAIP5)识别,与NLRC4相互作用,从而激活NLRC4炎症小体。沙门菌Ⅲ型分泌系统保守的杆状蛋白PrgJ能通过NAIP2激活NLRC4炎症小体。人类细胞中只有一种NAIP,能直接识别紫色杆菌分泌系统的针状蛋白Cprl而激活NLRC4炎症小体。NAIP具体通过何种机制参与NLRC4炎症小体的活化,目前尚不清楚。3.nlrp1炎症小体asc的激活人NLRP1除LRR、NACHT、PYD结构域外,C端尚有FIIND结构域(function-to-finddomain)和CARD结构域。因具有NACHT和FIIND两个寡聚化结构域,NLRP1炎症小体的活化机制和功能可能与众不同。ASC并非NLRP1炎症小体激活所必需,但ASC的存在能促进其活化。NLRP1识别细菌胞壁酰二肽(MDP)后发生构象改变并结合核苷酸,发生自身寡聚化,最终使caspase-1活化。炭疽致命毒素能诱导NLRP1bFIIND结构域发生裂解,裂解后的NLRP1b发生寡聚化并募集pro-caspase-1而使之活化。4.nlrp6表达NLRP6与NLRP3结构相似,为典型的PYD-NACHT-LRR结构。早期研究发现NLRP6与ASC在粒细胞和T细胞中共表达,可激活NF-κB,诱导caspase-1依赖性细胞因子成熟,因而认为其具有炎症小体活性。结肠上皮细胞中的NLRP6可通过调节肠道菌群组成维持肠道微生态平衡。目前关于NLRP6活化和调控的机制尚不明确。5.aim2炎症小体dcdaAIM2的HIN-200结构域能识别、结合触发抗病毒或炎症反应的胞质dsDNA,PYD结构域则结合ASC并募集pro-caspase-1,组装成AIM2炎症小体以激活caspase-1。迄今已知的AIM2炎症小体活化物包括土拉弗朗西斯菌、李斯特菌、嗜肺军团菌、牛痘病毒、小鼠巨细胞病毒等病原体的dsDNA。目前关于AIM2的研究甚少,其是否参与识别其他病原体的dsDNA以及内源性dsDNA,尚需进一步研究。三、caspase-1炎症小体的活化使pro-caspase-1成为有活性的caspase-1,诱导IL-1β、IL-18、IL-33等促炎细胞因子成熟、分泌。caspase-1尚能激活类固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)和释放生长因子,参与损伤修复和愈合过程。此外,caspase-1还可通过裂解多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP1)、糖酵解酶等影响细胞能量代谢和导致DNA片段化,使细胞发生特殊的程序性细胞死亡——细胞焦亡(pyroptosis),从而限制微生物在宿主细胞内的复制,在宿主先天免疫防御中起重要作用。四、cd组织化程度的检测NOD2/CARD15是第一个被发现的CD易感基因,其编码蛋白亦为NLRs家族成员。然而NOD2基因变异只能解释少部分CD患者的易感性,一般人群中NOD2基因常见变异与CD风险相关的外显率相当低,复合杂合子和纯合子携带者为1.5%,杂合子携带者仅为0.3%,表明尚有其他遗传因素参与了CD的发病。对瑞典人的研究发现NLRP3炎症小体组分NLRP3、CARD8基因多态性与NOD2等位基因为野生型的男性的CD易感性相关;对加拿大欧洲后裔的研究发现位于NLRP3基因下游调控区的一组SNPs与CD易感性相关,但该相关性未能在英联邦人群中被复制,表明此种相关性受地域和遗传背景的影响。NLRP3与NOD2同属于NLRs家族且结构相似,故进一步理解炎症小体在肠道炎症中的作用将有助于IBD发病机制的研究。1.基于il-18的免疫组化药动学模型目前多数研究显示NLRP3炎症小体可维持肠道内稳态,对实验性结肠炎具有保护作用,其功能缺陷可能导致对IBD易感。近年三个不同研究小组的实验均发现NLRP3炎症小体组分缺陷(NLRP3e或ASC或caspase-1)小鼠对葡聚糖硫酸钠(DSS)或三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎更为易感,模型小鼠肠上皮完整性丢失、肠道通透性增加、细菌易位、大量白细胞浸润、抗炎细胞因子IL-10和具有保护性的转化生长因子-β(TGF-β)表达下调,巨噬细胞对细菌MDP不产生应答,导致临床症状和结肠组织炎症明显加重,死亡率增高。此外,NLRP3小鼠实验性结肠炎加重尚与β-防御素产量和组成异常,导致结肠隐窝抗微生物剂分泌减少,结肠菌群组成发生改变有关。给予重组IL-18可使caspase-1小鼠的体质量减轻明显缓解,表明NLRP3炎症小体系通过IL-18对实验性结肠炎发挥保护作用,发挥作用的主要是肠上皮细胞中的NLRP3炎症小体。然而亦有研究发现NLRP3小鼠对DSS诱导的结肠炎耐受,其机制可能与结肠促炎细胞因子IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等产生减少有关。实验结果的不一致性可能是由实验小鼠的遗传背景、肠道菌群组成以及实验干预方案不同所引起。2.nlrc4炎症小体对肠道和宿主的保护作用有研究发现NLRC4小鼠的基础肠道内稳态以及由鞭毛蛋白引起的肠道基因表达谱迅速改变均不受影响,对抗IL-10受体单克隆抗体诱导的结肠炎亦不易感,但由DSS诱导的结肠炎加重,因此仍提示NLRC4炎症小体可通过产生IL-1β和IL-18对肠道和宿主起保护作用。另有研究发现对于病原体感染,肠道吞噬细胞中的NLRC4炎症小体能通过产生IL-1β影响肠道内皮黏附分子表达以及中性粒细胞的募集和病原体的清除,表明NLRC4炎症小体在区分肠道致病菌与共生菌以及促进宿主肠道防御功能中发挥重要作用。上述研究结果均表明NLRC4炎症小体在肠道炎症中发挥重要作用。3.炎症细胞计划有研究显示NLRP6小鼠肠道菌群发生改变,表现为普氏菌属(Prevotellaceae)明显扩增,导致肠黏膜自发性增生、炎症细胞募集,并通过诱导趋化因子CCL5表达使DSS诱导的结肠炎加重,提示NLRP6炎症小体信号通路受到干扰可能是IBD的易感因素或起始事件。另有研究发现NLRP6可保护肠上皮屏障的完整性,维持肠道内稳态,NLRP6小鼠对DSS诱导的结肠炎更为易感与其肠上皮损伤修复障碍有关。五、慢性肠道炎症与慢性肠道炎症的关系长病程IBD患者的CAC发生风险明显增高,此种高风险与慢性肠道炎症有密切联系。炎症小体信号通路异常将导致肠道炎症迁延不愈,在CAC的发生、发展中起重要作用。1.小鼠肿瘤负荷变化和il-18、stat1的关系以氧化偶氮甲烷(AOM)/DSS在NLRP3或ASC或caspase-1小鼠中诱导结肠炎和CAC,模型小鼠肿瘤负荷明显增加,其机制可能与NLRP3炎症小体组分缺陷致IL-18水平明显下调,使具有肿瘤抑制作用的干扰素-γ(IFN-γ)产生和STAT1活化异常有关。上述研究结果表明NLRP3炎症小体对CAC的发生具有保护作用,起保护作用的是造血细胞而非肠上皮细胞或间质细胞中的NLRP3炎症小体。2.caspase-1和野生型小鼠肿瘤负荷关于NLRC4炎症小体在CAC中的作用,目前观点并不一致。有研究发现caspase-1小鼠以AOM/DSS诱导CAC,模型小鼠肿瘤负荷明显增加,然而caspase-1在CAC发生中的作用并非通过调节结肠炎症,而是与调节结肠上皮细胞增殖和凋亡有关。另有研究发现NLRC4小鼠由AOM/DSS诱导的肿瘤负荷与野生型小