分子生物学：基因诊断

吉林大学基础医学院CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity基因诊断GeneticDiagnosis基因诊断的诞生简悦威（Yuet

Wai

Kan）1978年对镰状细胞贫血症进行特异性产前诊断，确立限制性内切酶长度多态性（RFLP，restrictionfragmentlengthpolymorphisms）在基因诊断中的应用。简悦威（Yuet

Wai

Kan）Disk-shapedSickle-shaped基因诊断的定义（重点）

通过检测致病基因（包括内源性基因与外源性基因）的存在、结构变化、量的多少及表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因及其表达的异常变化，并以此作为疾病确诊的依据。isatechniquetodiagnosediseaseorevaluatetheheathconditionofapersonfromtheabnormalityofDNAorRNA.Geneticdiagnosis第一节基因诊断的概念一、基因诊断的独特优势：利用分子生物学技术，通过检测基因及其表达产物的存在状态，对人体疾病、状态作出诊断的方法。具有以下特点：第一节基因诊断的概念基因诊断是从疾病的源头进行诊断！1）直击源头，病因诊断；2）特异针对某基因；3）PCR放大，灵敏度高；4）适用范围广。二、基因诊断的范围：

分子诊断（moleculardiagnosis）：使用分子生物学技术对DNA及产物（RNA、蛋白质）定量定性。基因诊断特指对DNA和RNA的分子诊断。第一节基因诊断的概念适应症：遗传病（单基因、多基因）感染（病原基因）三、基因诊断的定义（重点）

通过检测致病基因（包括内源性基因与外源性基因）的存在、结构变化、量的多少及表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因及其表达的异常变化，并以此作为疾病确诊的依据。isatechniquetodiagnosediseaseorevaluatetheheathconditionofapersonfromtheabnormalityofDNAorRNA.Geneticdiagnosis第一节基因诊断的概念第二节常用基因诊断技术基因诊断程序：

1.样品抽提DNARNAcDNA2.PCR扩增4.信号检测与分析合成寡核苷酸引物基因诊断操作PCR既是获得样品的手段，也可作为诊断方法3.分子杂交或测序

制备和标记探针（难点）第二节常用基因诊断技术常用基因诊断操作方法（分类I）：定性分析定量分析分析DNA序列信息单链构象多态核酸分子杂交实时PCRChipsDNAorRNA水平PCRDNA测序限制性酶切图谱分析S.Djebalietal.Nature489:101-108,2012DifferentialmRNAexpressioninseveralhumantissues第二节常用基因诊断技术常用基因诊断操作方法（分类II）：一、针对遗传病致病基因突变的直接诊断二、遗传病的间接诊断由于其检测结果直接、准确因此，是基因诊断的主要方法！一、针对遗传病致病基因突变的直接诊断1.基因缺失或插入（大片段）的直接诊断2.基因点突变的诊断3.动态突变的诊断SouthernBlotgap-PCRSouthern印迹法分析基因大片段丢失正常Genome：BamHI切割后得到14kb片段；而缺失α1Gene时：得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kb正常纯合子14kb10kb杂合子缺失纯合子病因：α珠蛋白基因的

α1

或

α2

发生基因缺失α地中海贫血CasestudySouthernBlotwitha-globingeneasprobea-thalassemia

Hb1~2a-globingenesdeletion杂交片段的大小的信息是该技术诊断基因缺陷的重要依据！20kb的缺失片段正常人：引物U和引物M扩增出1050bp的片段；而U和M由于距离太远，而无扩增产物。纯和缺失20kb时：引物M无结合位点，扩增不出产物；而U和D发生靠近，扩增出740bp的产物。Duchennemusculardystrophy(DMD)ischaracterizedbymusclefibersreplacedbyadipose(fat)cell.Itisduetothefunctionloss(viarecessivemutation)oftheDMD

geneontheXchromosome.HistopathologyofDMD.Dr.EdwinP.EwingJr./CDC.杜氏肌营养不良（DMD）多重PCR检测缺失的Exon.Casestudy杜氏肌营养不良多重PCR检测缺失的Exon.杜氏肌营养不良是一种致死性疾病，表现为肌肉进行性萎缩和乏力。70%的患者的病因：缺失不同的Exon。Gene：2300kb,79个Exon，cDNA：全长13974bp蛋白质：3685aa，分子量：427kD。Casestudy70%的患者的病因：DMD基因缺失不同的ExonGene：2300kb,79个Exon(已知最大的人类基因）cDNA：全长13974bp编码细胞骨架蛋白Dystrophin（3685aa，427kD）杜氏肌营养不良（DMD）多重PCR检测缺失的Exon.Casestudy病例外显子

Nor.123456bp535113Pm34350136476052说明:表示无条带.

Severaltargetgenesareamplifiedsimultaneouslyusingseveralpairsofprimersin1PCRreactiontube.

MultiplexPCR一、针对遗传病致病基因突变的直接诊断1.基因缺失或插入（大片段）的诊断2.基因点突变的直接诊断3.

动态突变的诊断SouthernBlotgap-PCR限制酶片段长度多态用等位基因特异性的寡核苷酸探针进行的点杂交应用ASO探针进行的反向点杂交DNAchips正常杂合子患者Casestudy序列分析用于基因诊断研究纯合子序列分析用于基因诊断研究TotalcostofsequencingahumangenomeascalculatedbytheNHGRI.（）

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)EcoRIEcoRIEcoRIHindIIIHindIII原理：可能导致酶切位点的改变：产生新的或消除原有的酶切位点。基因的多态性或基因突变，使DNA限制性片段长度发生变化。1).限制酶片段长度多态正常基因突变体基因MstII酶切位点点突变导致的镰形细胞贫血

CCTGTGG突变后该酶切位点消失!谷氨酸（Glu）缬氨酸（Val）CasestudyDisk-shapedSickle-shaped可将PCR与限制性酶切相结合分析(PCR-RFLP）。CCTGAGGB-chainofhomoglobin优点：简单、快速、可同时检测多个样品斑点杂交(Dotblot)是将核酸样品(或探针)

点到硝酸纤维素膜上，烘烤固定，然后与特定探针(或核酸样品)进行杂交。反向点杂交2).用等位基因特异性寡核苷酸探针进行的点杂交(reversedotblot,RDB)探针：等位基因特异性的寡核苷酸（allelespecificoligo-nucleotide,ASO）2).用等位基因特异性寡核苷酸探针进行的点杂交前提：知道常见的基因突变的部位和性质PointmutationisknownbutitdonotcauseREsitechange合成等位基因特异性寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO):wProbe和mProbe先将DNA的PCR产物如图纵向点2复孔；然后如图剪开，分别与合成的等位基因特异性寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO):wProbe和mProbe杂交此技术:一个杂交袋内进能用一种探针!检测多种突变（需要多种探针）时就显得很麻烦！2).用等位基因特异性寡核苷酸探针进行的点杂交检测基因的点突变

正常序列的探针常见突变序列的探针w/ww/mm/m3种基因型的DNA样品3).应用ASO探针进行的反向点杂交先将探针点到NC膜上然后将人该基因PCR产物和已经在膜上的探针进行斑点杂交。一次检查可以同时筛查多种突变！概念：

是指通过微阵列技术将大量已知序列的DNA探针按照一定次序排列、并固定在一块很小的硬质固相表面(如玻璃片)上，与荧光标记的DNA样品，进行核酸分子微杂交。杂交信号由激光共聚焦显微镜捕获，并由计算机实现数据分析和报告检测结果。高通量的基因检测的技术。AlsoknownasDNAMicroarray4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断Alsoreversedotblot4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断两份组织样本中的差异表达DNA芯片的类型cDNA芯片、微阵列寡核苷酸芯片表达芯片用于点突变的直接诊断现在已可在1.28平方厘米生物芯片上，用分子探针检测32Kb至几百Kb区域中任何区段，这对检测病人是一个、还多个基因突变，指导治疗和预后具有十分重要意义。

4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断One-channelfluorescence:4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断ProbeTemplateProbeTemplateIntensity探针设计（长度）与杂交退火温度设定影响检测结果。

4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）靶基因样品的制备：不同实验差异很大杂交反应，与常规的分子杂交过程基本相似预杂交杂交洗脱芯片信号（杂交信号）的检测将芯片置入芯片扫描仪中，激光会激发出芯片上的荧光，而且荧光的强弱与DNA--探针杂交程度有关。扫描仪大致分为两类：

①CCD（charge-coupleddevices，电荷偶合装置）②PMT（photomultipliertube，光电倍增管）预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。封闭试剂成分主要是大量的非同源性的核酸或蛋白质等。比较一下这两种设备各自的优缺点：

CCD一次可成像很大面积的区域，但是CCD有其缺点：目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16×12mm（像素为10μm），因此要达到整个芯片的面积20×60mm的话，需要数个数码相机同时工作，或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此或者需要激光头或者芯片进行机械运动，而使激光扫到整个面积，这样就需要耗费较多的时间来扫描。寡核苷酸DNAchip用于DNA测序

1、制作芯片：每点为8个碱基的ODN:AAAAAAAATAAAAAAA按改动一个碱基的顺序依次改动，共计48点，但我们知道每一点都是什么序列。2、如下荧光标记的序列TCGGATCGACTTA在测序芯片上可发生杂交的点为对未知序列的测序：根据杂交阳性斑点（我们知道每一点都是什么序列）我们能推论出该序列是什么。TCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGACTTA了解4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断了解casestudy目的：要检测mtDNA全序列（16569个碱基）的SNP（单核苷酸多态,singlenucleotidepolymorphism）4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断TheupperDNAmoleculediffersfromthelowerDNAmoleculeatasinglebase-pairlocation(aC/Apolymorphism).W单个核苷酸碱基改变，包括碱基转换、颠换、插入和缺失；遍布人类基因组，平均密度达1/1000bp（密度比微卫星标记高）；可直接影响蛋白质结构或表达水平，因而可能代表遗传病机理中的某些作用因素。SNP(singlenucleotidepolymorphism) Singlebase-pairdifferencesbetweenindividualsTransition:substitutionbetweenpurines(A,G)orbetweenpyrimidines(C,T).ConstitutetwothirdsofallSNPs.Transversion:substitutionbetweenapurineandapyrimidine.Happensat1/（200~500）bpMajorsourceofgeneticvariation(90%).

在人群中，基因组DNA的序列：大约平均200~500bp就会有一个核苷酸的差异。这使个体之间广泛存在地着DNA单核苷酸序列的差异。SNPishotbecauseofitsclinicalrelevanceForexample:sickle-cellanaemia(SCA)：SNPintheβ-globingeneβthalassemias：SNPinthetheHBBgeneonchromosome11Cysticfibrosis：SNPcausingdysfunctionalCFTRproteinSNPintheAPOE(apolipoproteinE)geneisassociatedwithahigherriskforAlzheimer'sdisease.NeurobiologyofAging.201234(4):1007–17.SNP与个体的疾病易感性和药物反应性相关！SNP(singlenucleotidepolymorphism) 了解4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断一、探针的设计：目的基因有多少个碱基就设计多少组探针：第一组探针的序列对应于目的基因的1～15碱基第二组探针的序列对应于目的基因的2～16碱基每组4个探针：每组探针的第2个碱基（从3

端开始）分别为A、C、G、T。共需合成165694=66276个探针。合成的探针固定到特殊材料的芯片上。

mtDNAsequence

5

TCAACTGTATCCGACAT………

第一组探针的1-4：

1：3AATTGACATAGGCTG2:3ACTTGACATAGGCTG3:3AGTTGACATAGGCTG4:3ATTTGACATAGGCTG第一组探针对应mtDNA序列的第1至第15位碱基。这一组的4个探针对应检测mtDNA序列第2位碱基G的替换，如G变成A则mtDNA与第4个探针互补，不突变时，则与探针2互补。第二组探针的1-4：

5:3CATGACATAGGCTGT6:3CCTGACATAGGCTGT7:3CGTGACATAGGCTGT8:3CTTGACATAGGCTGT第二组探针对应mtDNA序列的第2至第16位碱基(向后移动一个碱基)。对应检测mtDNA第3位的突变。

1234567890123456……..（？）了解4).DNA芯片(DNAchip)用于点突变的直接诊断二、待测样品的制备：设计mtDNA-表达质粒：体外转录为单链RNA，转录过程中，加入荧光标记的dCTP，使转录后RNA带上荧光标记，然后调整MgCl2浓度，并在94oC加热40分钟，使单链断裂成小于100bp的均一小片段，三、与芯片上的一系列探针杂交。四、杂交后，洗膜去除未杂交的RNA，荧光显微镜观察结果，

lightsignal-scaner-digitalsignal-计算机统计杂交数据如下图：1234567891011121314151617TGAACTGTATCCGACATAC＊GTThisissequencingbyhybridization(SBH)。随着人类基因组测序工作的完成，人们可根据已测定的序列设计探针，用DNA芯片技术检测全基因组的SNP(singlenucleotidepolymorphism)。芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势：表达型芯片：它可以仅用极小量的样品，在极短时间内，在一张芯片同时对病人的多种mRNA的丰度进行高度准确、高度自动化地检测。

表达型芯片：用于分析肿瘤组织mRNA的表达。基因芯片的应用a.发现疾病相关基因基因芯片可用于寻找和鉴定与疾病相关的基因。

例如，北京大学的科研人员应用基因芯片技术，发现了在前列腺癌的发生、发展中起重要促进作用的基因，从而为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的依据。b.用于传染病的检测利用基因芯片可以准确而快速地检测传染病。

目前，人们已开发出用于检测流感、艾滋病、肝炎等病毒的基因芯片。H5N1型流感病毒流感病毒(H1)流感病毒(H2)流感病毒(H5)

流感病毒(……)

流感病毒(H15)

流感病毒(N1)

流感病毒(N2)

流感病毒(……)

流感病毒(N9)病毒基因组检测芯片(病毒分型）04年23日c.基因芯片技术与医学行为的改变。例如：对患恶性淋巴瘤的病人进行化疗，有的病情会急剧恶化，约有40%的病人能继续保持缓解趋势。

基因芯片的应用发现这种现象与不同患者肿瘤细胞内基因活动的情况不同有关。GenomeWideAssociationStudy(GWAS)ManhattanplotforconstrictedmicrocirculationGWAstudiestypicallyidentifycommonvariantswithsmalleffectsizes(lowerright).W推动医学研究新进展：SNP与疾病的相关性衡量，开启对突变致病机理的研究。APOE4(Alzheimers)d.有助于发现不同个体对疾病易感性的差异，及早预测将来对患某种疾病的风险。

例如，在少年时期预测出以后患老年性痴呆、糖尿病和某种恶性肿瘤的风险，从而对易感者尽早进行密切监测和预防性治疗。5).变性高效液相色谱（DHPLC）2.变性后缓慢复性ATAT正常GC点突变+异源双链AC1.首先用PCR方法扩增目的DNA片段。GTGC同源双链3.DHPLC4.根据是否会出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。一、针对遗传病致病基因突变的直接诊断1.基因缺失或插入（大片段）的诊断2.基因点突变的诊断3.

动态突变的直接诊断SouthernBlotgap-PCR限制酶片段长度多态用等位基因特异性的寡核苷酸探针进行的点杂交应用ASO探针进行的反向点杂交DNAchipsDHPLC

shorttandemrepeat3.动态突变的直接诊断短串联重复序列不同人的STR的拷贝数可能存在差异，可作为不同个体的遗传标志；病因：X染色体上FMR-1gene的5’UTR内的STR（CGG）的copy数由正常人的5~50增加为200以上。结果是：该基因的转录被抑制。症状前携带者：50~200个拷贝。Casestudy脆性X综合征

2)有时候其拷贝数的大幅度突然增加也是导致某些遗传疾病发生的原因，称为动态突变。正常杂合异常200bp400bp600bpMrABC正常人CGG的copy数为5~50,PCR产物长度小于200；患者(全突变)CGG的copy数>200，因此PCR产物长度>600。基因的定量的分析：实时定量-PCR对PCR扩增反应中每一个循环的产物通过荧光信号进行实时检测,从而实现对起始模板（DNA/cDNA)的定量分析。

TaqMan探针是一种水解型杂交探针，合成其所在的DNA链时就会发出荧光！遗传病基因突变

插入

缺失基因长度改变:PCRorSouthernblot

扩增重排Thesemethodsaremorecommonused,butDNAsequencinggivesdirectevidence.一、针对遗传病致病基因突变的直接诊断点突变PCR-RFLPASO-dotblotDNAchipsASO-RDB遗传性疾病诊断—单基因遗传病第二节常用基因诊断技术常用基因诊断操作方法（分类II）：一、针对遗传病致病基因突变的直接诊断二、遗传病的间接诊断二、遗传病的间接检测的主要方法RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphysm)Microsatellite

VNTRs:VariableNumberofTandemRepeats

STR:2~4bpShortTandemRepeatsSNP(singlenucleotidepolymorphism) 优点

在不了解致病基因结构及其分子机制的情况下缺点没有直接检测致病基因突变，是间接诊断M1PABCM2

P:PCRproduct；A:RSaI;B:HaeIII;C:PstI;Case1:Case2:酶切不同型的HPV病毒的L1基因片段20001000750500250100可以对HPV病毒的型别进行初步的定性分析。M1PABCM2

M1:174-HaeIIIdigestDNAmarkerM2:DNAmarkerDL2000bpRFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphysm)

基于短串联重复序列(STR,属于微卫星DNA)的分析串联重复序列

*人类基因组中存在的、由某种核心序列彼此串联重复排列而成的特殊序列。

*不编码蛋白质。repetitive

DNA碱基组成与其它部分不同，富含GC。

串联重复序列（tandemrepetitiveDNA）重复单位为2～70bp。例如:(GAGGCGG)n真核生物基因组酶切、用密度梯度离心后，在主体DNA附近会出现的比重不同的DNA片段。卫星DNA

SatelliteDNA大卫星DNA：

100kb-1Mb小卫星DNA：

1kb-20kb微卫星DNA

：

<150bp5～70bp9～30bp2～7bp高度多态LengthNumberofrepeatsRepeatunit

alsoknownasshorttandemrepeats(STR).

VariableNumberofTandemRepeats(VNTR)TelomereDNA(端粒)：重复序列(TTAGGG)n中度重复中度重复高度重复Macro-satelliteDNAMini-satelliteDNAMicro-satelliteDNA高度多态10~602～4bp卫星DNA

SatelliteDNAVNTR和STRSTR(短串联重复序列）

*是基因组中的一种串联重复序列。

*重复单位：2~4bp。

*总长度：<150bp。在人类基因组中分布广泛遗传保守性：在同一家系内以孟德尔方式遗传。在人群中呈高度多态性：每个个体的核心序列、及其重复次数不同。特点VNTR和STR不同人的卫星DNA（小、微）重复次数不同按照孟德尔遗传规律遗传，是很好的遗传标记。扩增片段长度多态性Ampifiedfragmentlengthpolymorfhism,AFLP通过PCR技术，扩增致病基因内部或两侧与其紧密连锁的特定STR，经电泳检测扩增片段长度的多态性，从而实现基因诊断。

小、微卫星DNA等DNA重复序列在不同个体间的重复次数不同，变化很大，具有个体特异性，犹如指纹之千差万别而被命名为DNA指纹。

DNA指纹（fingerprinting)：是重要的多态性标志。

VNTR和STR不同人的卫星DNA（小、微）重复次数不同AATG6repeats7repeatsPCRThenumberofrepeatsforagivenmini-ormicro-satellitemaydifferbetweenindividuals.ThisfeatureisthebasisofDNAfingerprinting.按孟德尔方式简单、稳定地遗传是很好的遗传标记DNA指纹（fingerprinting)：*Agivenperson’sVNTRsareinheritedfromtheparents,butneveraVNTReitheroftheparentsdonothave.亲生儿女1234无关子女父母重复次数234567810

R1R2

R1R2R3R4R5R6R1R2R3R4R5R6R7R8

R1R2R3

高度的特异性DNA指纹与亲子鉴定10STRsbiologicaldaughter,biologicalsonofacoupledaughteroftheMomandherformerhusbandadoptedson,notbiologicallyrelatedDNAextractionfromapieceoftissuesampleREdigestionElectrophoresisSouthernblotwithmini-/micro-satelliteprobesHowtodoDNAFingerprinting?

PCRElectrophoresisDNA指纹与破案D

isDefendant(被告)VisVictim(受害人)

*Datashowsthatthebloodstainsondefendant’sclotheshavevictim’sDNA.DNAfingerprintinganalysisDNA序列测定是最精确的方法！实时PCR、Chips是定量分析基因的最好方法！方法优点与问题DNA测序可自动化PCR-RFLP结果可靠，但限制较多核酸分子杂交用途广泛，但操作繁琐实时-PCR灵敏度、特异性高基因芯片效率高，成本高小结：基因诊断常用的分子生物学技术实时PCR、DNA芯片诊断技术已经成为临床检验、科学研究中使用的常规技术。PCRisusedtoamplifySTRregionsandlabeltheampliconswithfluorescentdyesusinglocus-specificprimers8repeats10repeatsLocus18repeats9repeatsLocus2NOW:片段大小不同相同大小时荧光颜色不同ScannedGelImageLocus13TheFBIhasselected13coreSTRlocithatmustberuninallDNAtests.CapillaryElectropherogramTheFBIhasselected13coreSTRlocithatmustberuninallDNAtests.ScannedGelImageIdentifyindividuals

I.Paternityandmaternitytesting亲子鉴定

II.Forensicmedicine(法医学):CriminalidentificationThecommon-usedtechniqueisDNAfingerprinting法医学鉴定—DNA指纹检测基因的分析的应用√SatelliteDNA–HighlyrepetitiveDNAMinisatellites(VNTRs=variablenumbertandemrepeats)Repeatedunitsof5toseveral10bpDiscoveredbyA.J.Jeffreysin1985Microsatellites(STRs=shorttandemrepeats)Repeatedunitsof2-4bp√Varyinnumberbetweenindividualsbutareinherited.DNAmarkersforDNAfingerprinting---hypervariablebetweenindividuals---inheritedSatelliterepeatsarethebasisoftheDNAfingerprintingtechnique一、基因诊断是疾病检测和风险预测的有力工具二、基因诊断可以用于疗效评价和用药指导三、DNA指纹鉴定是个体识别的核心技术第三节基因诊断的医学应用√遗传病相关基因突变的检测及产前诊断√感染性疾病的诊断早期诊断、病程监控（病毒核酸定量）预后评估与患病风险评估（病毒分型）√肿瘤基因的检测：癌前病变、肿瘤的耐药性

采用分子生物学技术，可直接检测相关基因的点突变、插入、缺失、扩增、重排等遗传缺陷，结果可靠。尤其对于单基因遗传病，诊断方便确实。虽然肿瘤与多种因素有关，发病过程复杂，表现多种多样。但从根本上讲，其发生发展和演进均与某些基因的变化密切相关。肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因）发生突变而导致的疾病。肿瘤相关基因的突变只是增加了个体对肿瘤的易感性而并不一定马上产生肿瘤，肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程。Today,mostwillagreethatalldiseasehasageneticfactors.

singlegenedefect

diseaseshaveasimplegeneticorigin–only2%orlessofhumandisease.Thevastmajorityareso-calledcomplexdiseases

–diabetes,heartdisease,Parkinson’sdisease,tumor.–inwhichillnessprobablyresultsfromsubtlechangesinmultiplegenesinteractingwithenvironmentalandlife-stylefactors.从分析基因本身及其表达变异着手对疾病进行诊断跟踪监测、个体化用药例如：针对遗传病致病基因点突变的直接诊断PCR产物直接测序用ASOprobe进行：斑点杂交、反向斑点杂交寡核苷酸芯片：用于点突变的直接诊断AS-PCR（等位基因特异PCR）:有限制性内切酶位点改变----PCR-RFLP设计一对3´端与正常或突变模板配对的特异引物.A.遗传病相关基因突变的检测所有点突变根据引物3´端的互补与否，病因：外源病原体侵入人体内，复制繁殖。诊断：直接定性、定量检测病原体的核酸技术：实时PCR

基因芯片优越性：特异、敏感、快速、B.感染性疾病诊断早期诊断、病程监控（病毒核酸定量）疗效评估与患病风险评估（病毒序列、病毒分型）C.肿瘤的基因诊断1、DNA甲基化程度的检测：肿瘤的早期诊断2、原癌基因与抑癌基因的检测：肿瘤的分期肿瘤标志物、标志基因肿瘤相关基因1.DNA甲基化的程度与肿瘤的发生在哺乳动物：DNAmethylationMethylationoftenhappenedonCGdinucleotide.★甲基化常发生在双链CpG岛的胞嘧啶上。★形成的回文结构为：

5’mCpG3’3’GpCm5’★大多数CG序列是被甲基化的。真核基因常以甲基化方式调控基因的表达。启动区DNA分子上的甲基化程度与基因表达多呈负相关。

例如雌性哺乳动物细胞中有两个X染色体，一个是活化的，另一个是不活化的。这个不活化的X染色体是高度甲基化的。如果用5－氮杂胞嘧啶处理使DNA去甲基化，就可以活化这个X染色体