内源性神经营养因子在化脓性脑膜炎时的表达及意义

内源性神经营养因子在化脓性脑膜炎时的表达及意义

脑源性神经营养因子（cnf）是神经养分家族的第二个成员。在神经系统发育过程中，它对各种神经元的分配、分化、生存和损害后的再生起着重要作用。近年来，nbf与免疫系统和内政部系统之间的关系也得到了关注，但理解仍然很少。地塞米松(DEX)被提倡使用于化脓性脑膜炎(化脑)作为抗炎治疗,但它是否能改善化脑的死亡率和神经系统后遗症尚有争议,回顾性调查和实验研究发现它能减少肺炎链球菌脑膜炎死亡率和听力障碍等神经系统后遗症。在化脑时DEX是否能调节内源性BDNF表达,发挥神经保护作用尚不清楚。我们通过化脑模型加用DEX治疗,以观察其神经保护作用。免疫组化染色采用肺炎链球菌Ⅲ型菌株(31003_16),在37°C5%CO2环境中于VITALAER肉汤里生长过夜,至对数生长中期收菌,用生理盐水冲洗2次,再稀释成每ml107克隆形成单位(colonyformingunits,cfu)。采用3周龄SD大鼠30只,雌雄不限,取自浙江大学医学实验动物中心。用10%水合氯醛(0.15~0.3ml/100g体重)腹腔注射麻醉大鼠后,固定于立体定位仪。脑膜炎的诱导按Diab报道进行,脑池穿刺,移去50μl脑脊液,注入肺炎链球菌悬液50μl。接种后24h,取脑脊液50μl检查,计白细胞总数,结果感染后较感染前明显升高,并以中性粒细胞为主。脑脊液感染前培养无细菌生长,感染后培养出与接种同株的肺炎链球菌。将实验动物随机分成3组,各组10只。(1)感染后24h组:感染后24h不做任何处理即处死。(2)抗生素治疗组:感染后24h给予头孢曲松皮下注射,共3天,于第5天处死。(3)抗生素加DEX治疗组:感染后24h给予头孢曲松皮下注射+DEX3mg/(kg·d)腹腔内注射,共3天,于第5天处死。3组大鼠都经主动脉灌流生理盐水及4%多聚甲醛,剥离组织,再浸入4%多聚甲醛4°C后固定4h,移入30%的蔗糖溶液过夜。经海马冠状面冷冻切片,厚30μm。免疫组化二步法染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司,二步法染色按试剂盒说明进行。兔抗大鼠多克隆抗体BDNF是美国Chemicon产品,购自晶美生物工程有限公司。用PBS替代一抗作为阴性对照。免疫组化染色结果,经计算机图象分析系统图象扫描分析,每个切片取10个高倍镜视野,测量每个视野阳性面积比。计量资料用均值±标准差(ue0af±s)表示,采用方差分析,当差异有显著意义时,行两两q检验,P<0.05为显著界值。软侧脑室、脑室及脑实质炎性渗漏感染后24h大鼠均有明显的临床表现,经敏感的抗生素或抗生素加DEX治疗后症状缓解,两组之间差异无显著性。见表1。免疫组化染色结果显示,感染后24h组BDNF蛋白在脑组织广泛区域表达,在软脑膜、蛛网膜下腔、脑室及脑实质炎性病灶内,渗出炎性细胞有BDNF蛋白高表达;抗生素治疗组BDNF蛋白在脑组织表达稀少,多数区域无阳性染色颗粒,仅在少部分皮质区可见极少量密集的阳性染色颗粒,与感染后24h组相比差异有显著性(P<0.01);抗生素加DEX治疗组BDNF蛋白在海马表达明显,皮层表达在抗生素组区域的基础上广泛增加,与抗生素治疗组比较差异有显著性(P<0.01),但仍未达到感染后24h组的水平(P<0.05)。治疗后两组软脑膜、蛛网膜下腔、脑室及脑实质炎性病灶内炎性渗出已不明显。阴性对照未见免疫组化阳性染色颗粒。dex对脑损伤的保护作用化脑致中枢神经系统损伤主要是由于宿主的炎症反应,在使用敏感抗生素后,细菌成分释放到脑脊液增加毒性炎症反应,引起一系列的病理生理变化,由此,临床上提倡加用DEX与抗生素联合应用治疗化脑。至今DEX是否能减少化脑的死亡率和神经系统后遗症尚有争议。Shembesh等报道DEX能改善化脑的急性炎症反应和缩短发热时间,而不影响死亡率和神经系统后遗症的发生。回顾性调查发现DEX辅助治疗可明显减少肺炎链球菌脑膜炎的死亡率和后遗症。一些临床观察也发现DEX与抗生素并用可减少听力障碍,尤其是感音性听力下降等后遗症的发生。Jamie等实验研究证实,DEX辅助治疗减少或防止感音性耳聋发生,改善听阈值,特别是在病程的早期效果显著。然而,至今仍缺少从分子水平探讨其保护化脑脑损伤直接证据的报道。我们的研究结果显示,感染后24h,在脑组织和渗出的炎症细胞均有高水平表达的BDNF蛋白,抗生素治疗后,脑组织BDNF蛋白表达降到很低水平;DEX辅助治疗后能明显地增加BDNF蛋白在脑组织的表达,但没有达到治疗前水平。这一研究结果表明,感染后24h,脑组织和炎症细胞所呈现的内源性BDNF表达增加,能起到一定的神经营养作用。单独使用抗生素治疗后,BDNF蛋白的合成可能受到某种影响,而DEX在一定程度上可能阻止了这一影响过程。用抗生素治疗化脑时,产生大量的细菌产物刺激脑细胞和炎症细胞表达细胞因子和炎症因子。其中肿瘤坏死因子(TNF_α)和白介素1(IL_1)作为先驱因子协同触发一系列的炎症介质。研究表明,IL_1和TNF_α可减低BDNFmRNA表达。单独使用抗生素治疗后这些细胞因子有可能抑制BDNFmRNA的表达,而使BDNF处于较低的水平。实验研究证实,DEX可抑制IL_1和TNF_αmRNA表达。已有的研究证实,BDNF具有潜在的神经保护作用,在各种脑损伤时,BDNF表达增加并能抵御损伤所致的神经元死亡。脑缺氧缺血后,脑内广泛区域尤在海马出现BDNF表达明显增加,呈现抵御缺氧缺血致脑损伤的内源性神经保护作用,脑室内注射外源性BDNF治疗缺氧缺血所致脑损伤,可明显缩小脑梗死灶以及增加存活神经元的数量,抑制细胞凋亡,恢复记忆功能,尤其是对发育早期的缺氧缺血脑损害其作用更突出[10~12]。当听神经和毛细胞受损时,BDNF能提高和保护听神经细胞的存活并诱使之再