s萘普生分子印迹聚合物的合成与结构表征

s萘普生分子印迹聚合物的合成与结构表征

分子印花技术是一种新型有效的分离技术，旨在模拟生物内的抗体、酶或酶与底物之间的专一性相互作用而发展的。分子印花聚合物是由该技术制备的具有特定识别功能的高聚物。通过将高聚物分子整合到聚合物分子（测量或分离的分子）、功能单体、交联剂和可能的固状材料后，对模型分子进行清洗、去除，然后获得模型分子。聚合物中模型分子留下的空孔和空孔中的活性基团与模型分子的形状和官能团是互补的。即使是难以分离的异构体，也可以进行分析和分离。作为一种高选择性分子分子，该算法在分子识别和生物医学技术的免疫分析中具有良好的应用前景，引起了人们的关注。萘普生(2-(6-甲氧基-2-萘基)-丙酸),为2-芳基丙酸类药物,是解热、镇痛、消炎抗风湿的基本药物,其中α位为手性碳原子,因此存在一对光学活性对映体.临床研究表明,萘普生S-(+)-构型的药效为R-(-)-构型的28倍.为了减少用药量及避免对人体的毒副作用,萘普生将被要求逐渐以纯对映异构体形式上市,这对萘普生的拆分及检测提出了较高要求.本文以丙烯酰胺为功能单体合成了(S)-萘普生分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymer,MIP),研究其对(S)-萘普生的识别特性.分析了不同浓度的功能单体丙烯酰胺对(S)-萘普生的紫外吸收光谱的影响,为MIP的制备提供依据.模板分子与功能单体的复合物的分子结构用Hyperchem软件进行模拟,并计算其结合能.检测了分子印迹聚合物对模板分子(S)-萘普生及其对映异构体(R)-萘普生的选择性结合能力,并计算了分离因子α.用Scatchard分析法评价了MIP的结合等温线,并得到高亲和力和低亲和力的结合位点的离解常数Kd和最大表观结合常数Qmax.1实验部分1.1-三甲基苯甲酰苯基磷酸乙酯(S)-萘普生和(R)-萘普生(浙江省天新药物化工有限公司);交联剂二丙烯酸丁二酯(BDDA)及光引发剂2,4,6-三甲基苯甲酰苯基磷酸乙酯(LR8893X)(德国BASF公司);丙烯酰胺、氯仿、甲醇及乙酸等试剂(上海化工厂).2201型紫外可见分光光度仪(日本Shimadzu公司);THZ-82型恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂);100CX液氮N2吸附仪(美国OMNISORP公司);Hyperchem7.0软件(Hypercube,Inc).1.2功能单体丙烯酰胺的检测模板分子(S)-萘普生的浓度固定为C0=0.5mmol/L,加入不同量的功能单体丙烯酰胺(浓度C1分别为0,0.5,1.0,2.0,4.0mmol/L),在恒温器中振荡12h后,用相应浓度的丙烯酰胺溶液作为参比液,检测紫外吸收光谱的变化.1.3结构模拟和分析方法因为现代计算方法还难以模拟高度交联的MIP结构,目前主要着重于MIP制备的第1步,即模拟模板分子和功能单体分子形成的复合物.用Hyperchem7.0模拟此复合物的分子结构.首先分别模拟(S)-萘普生及丙烯酰胺的最低能量构象的分子结构,然后经过系统能量优化得到两者形成复合物的分子结构.1.4空白聚合物的制备取模板分子(S)-萘普生(4mmol)和功能单体丙烯酰胺(16mmol)充分溶解于氯仿中,再加入交联剂BDDA(80mmol)和引发剂LR8893X(50mg),通N2,10min后,于4℃,紫外灯光照下聚合48h,得到白色固状聚合物.用甲醇-乙酸(体积比为8∶2)洗脱聚合物至洗脱液中检测不出模板分子,最后用甲醇洗去残留乙酸,真空干燥至恒重.空白聚合物如上法所制备,只是不加入模板分子.1.5复配体分离性测定取聚合物20.0mg放入10mL锥形瓶中,加入2.0mL已知浓度的(S)-萘普生或其对映异构体(R)-萘普生的氯仿溶液,于室温下在恒温振荡器中振荡24h.然后将此混合物转入离心机中以10000r/min转速离心10min.用紫外分光光度仪测定(S)-萘普生或其对映异构体的平衡浓度.根据结合前后溶液中浓度的变化计算聚合物对底物的结合量.平行测定3次取平均值.结合分配系数KD=CpCsΚD=CpCs式中,Cp为聚合物结合底物的浓度;Cs为溶液中底物的平衡浓度.分离因子α可定义为2种不同底物的结合分配系数之比.为研究聚合物的结合动力学性质,取50.0mg聚合物与5.0mL的浓度为2.0mmol/L的(S)-萘普生氯仿溶液混合,在不同的时间分别测定(S)-萘普生在聚合物上的结合量.2结果和讨论2.1克氏原螯虾c-普生-四氢化反应中金属酶表型的变化在浓度C0=0.5mmol/L的(S)-萘普生氯仿溶液中分别加入浓度不同的丙烯酰胺,观察(S)-萘普生的紫外光谱的变化,研究模板分子与单体之间的作用力.如图1所示,随着丙烯酰胺浓度C1的增加,(S)-萘普生的最大紫外吸收波长出现红移,而且波峰强度在不断降低.这说明在模板分子和功能单体之间确实已产生了作用力并形成复合物.根据模板分子和功能单体的结构,两者之间的作用力应该是氢键.2.2分子丙烯酰胺与一分子s-普生-分子s-分子s-分子s-分子s-分子s-分子s-分子s-分子(S)-萘普生与丙烯酰胺形成的复合物的可能结构用Hypechem软件模拟,如图2所示.其中较大的分子为(S)-萘普生,旁边的小分子为丙烯酰胺.(S)-萘普生与丙烯酰胺组装的可能模型有2类,模型1为一分子丙烯酰胺与一分子(S)-萘普生的羧基形成2个氢键;模型2为两分子丙烯酰胺与一分子(S)-萘普生结合,除了前面提到的氢键,丙烯酰胺与(S)-萘普生的甲氧基之间也形成氢键.这2种复合物都有可能出现在高分子母体材料中,经过模板洗脱后,就能形成2种识别(S)-萘普生的印迹空穴.一分子丙烯酰胺与一分子(S)-萘普生的结合能计算得到-355.68kJ/mol,而两分子丙烯酰胺与一分子(S)-萘普生的结合能计算得到-616.42kJ/mol.前者形成低亲和力的结合位点,而后者形成高亲和力的结合位点.图2(S)-萘普生和丙烯酰胺形成复合物的结构模型2.3mip对模板分子的作用测定了(S)-萘普生MIP对不同浓度的模板分子(S)-萘普生的结合量Q,绘制成结合等温线,其中(S)-萘普生的浓度C0从0变化到5.0mmol/L,如图3中曲线a.MIP对(R)-萘普生及空白聚合物对(S)-萘普生的结合等温线分别见图3中曲线b和c.比较曲线a与c可知,MIP对模板分子的结合量要明显高于空白聚合物.这说明印迹过程中,模板分子在MIP中留下的印迹空穴及空穴上的活性结合位点决定了MIP对模板分子的高度亲合力和特异识别性.曲线a和b表明(R)-萘普生在MIP上的结合量要比(S)-萘普生低,这是因为(R)-萘普生的分子结构不能与MIP中的印迹空穴的形状吻合,并不能同(S)-萘普生一样和空穴上的结合位点形成较强的作用力而造成在MIP上的结合性不强.在底物浓度为2.0mmol/L时,测定了MIP对(S)-萘普生的结合分配系数KD=76.6mL/g,明显高于空白聚合物对(S)-萘普生的KD=14.1mL/g.MIP对(R)-萘普生的KD值为40.97mL/g,则手性分离因子α=1.87,表明MIP对模板分子及其对映异构体有较好的选择性.2.4mip中的结合位点MIP对(S)-萘普生的结合等温线可用Scatchard法分析,其等式为QC0=Qmax−QKdQC0=Qmax-QΚd式中,Q为MIP对(S)-萘普生的结合量;Qmax为表观最大结合常数;Kd为结合位点的平衡离解常数.以Q/C0对Q作图得到图4.当Scatchard曲线是非线性的,表明MIP对(S)-萘普生的结合位点是各向异性的.图4中的点分布在2个部分,并分别具有明显的线性关系,这表明MIP中可能存在2种结合位点.图4中左边实验点(▲)的回归直线方程是y=-35.6818x+94.4559,其回归常数r=0.9987.由回归模型的斜率和截距,计算得高亲和力的结合位点的离解常数Kd,1和最大表观结合常数Qmax,1分别为28.0μmol/L和52.94μmol/g.右边实验点(■)的回归直线方程是y=-2.0458x+12.5021,其回归常数r=0.9858,计算得低亲和力的结合位点的离解常数Kd,2和最大表观结合常数Qmax,2分别为0.489mmol/L和0.122mmol/g.MIP中存在2种结合位点主要是由于模板分子和功能单体在聚合过程之前可形成2种复合物(如2.2中模拟所示),在聚合过程中被固定下来,并随后因洗脱而在MIP中形成2种结合位点.2.5结合速率的确定为测量(S)-萘普生在MIP上的结合速率,通过紫外检测了浓度为2.0mmol/L的(S)-萘普生在50.0mgMIP上不同时间的结合量,如图5所示.在前40min,结合速率非常快,几乎呈线性关系,然后结合速率有所降低.2h后,结合量基本达到饱和.这是因为吸附开始阶段,模板分子被聚合物表面的印迹孔穴捕获,结合速率较快.在表面空穴被饱和后,模板分子要传送到聚合物内部的空穴需花更长的时间,结合速率变慢.2.6聚合物洗脱前后孔结构比较用液氮吸附仪多点BET法测得MIP洗脱后的总孔体积为0.1759cm3/g,比表面积为137.96m2/g,均高于聚合物洗脱前的总孔体积0.1032cm3/g及比表面积105.86m2/g.可以看出MIP为多孔材料,而洗脱后聚合物中孔结构与洗脱前相比要多得多.正是这种孔结构上的差异,造成MIP对模板分子的良好选择性,而这孔结