细胞化学染色课件

细胞化学染色检验

申家辉11精选PPT细胞化学染色检验申家辉11精选

一、概述二、细胞化学染色的基本方法三、临床应用

22精选PPT一、概述22精选PPT

1、概念：

细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门科学，以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（包括酶类、脂类、蛋白质、糖类、铁、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。3一、概述3精选PPT1、概念：3一、概述3精选PPT

2.细胞化学染色的目的

（1）辅助判断急性白血病的类型（2）辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断4精选PPT2.细胞化学染色的目的4精选PPT

3.细胞化学染色的基本步骤：包括固定、显色反应、复染。（1）固定：为了保持细胞结构及化学成分的稳定性而选用的方法。根据染色的目的，最常用的固定剂有甲醛、甲醇、乙醇等。

55精选PPT3.细胞化学染色的基本步骤：包括固定、显色反应、复染。5

（2）显色：通过不同的化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，使被监测的化学物质显示出来。包括偶氮偶联法：如NAP、ACP及各种脂酶染色普鲁氏蓝反应：如铁染色雪夫（shiff）反应：如PAS染色联苯胺法：如POX染色

（3）复染：使各种目的细胞能显示出来更便于观察

66精选PPT（2）显色：通过不同的化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，使过氧化物酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色糖原染色非特异性酯酶染色特异性酯酶染色骨髓铁染色7二、细胞化学染色的基本方法7精选PPT过氧化物酶染色7二、细胞化学染色的基本方法7精选PPT

1、原理：poxH2O2

O

联苯胺联苯胺蓝+

亚硝基铁氰化钠8蓝黑色颗粒（一)过氧化物酶(POX)染色8精选PPT8蓝黑色颗粒（一)过氧化物酶(POX)染色8精选PPT

2.试剂

(1)联苯胺酒精溶液：取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml,再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。

(2)稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加30%H2O21滴。（3）瑞吉氏复染液

99精选PPT2.试剂99精选PPT

3、染色方法

1、新鲜干燥涂片加联苯胺酒精溶液10滴，覆盖整个髓膜，固定1-2min。2、再加等量的稀H2O2，混匀后染色4－5min,勿倒去染液直接流水冲洗。3、瑞氏染液复染。1010精选PPT3、染色方法1010精选PPT

4、注意事项

（1）H2O2要新鲜配制，注意有效性（2）标本要新鲜，最长不超过一周，时间长了酶活性减弱。（3）POX染色后，一定要冲洗干净，否则染料堆积或浮于表面，影响瑞氏染色结果观察。1111精选PPT4、注意事项1111精选PPT

5、结果判定：中性粒细胞杆状及分叶核呈强阳性是染色成功的标志(设对照片）。在细胞的胞浆中出现蓝绿色或蓝棕色颗粒为阳性反应。1212精选PPT5、结果判定：中性粒细胞杆状及分叶核呈强阳性是染色成功的1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性；3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性13精选PPT1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性；3.单1414精选PPT1414精选PPT急性粒细胞白血病（M2a)的POX染色原始粒细胞均呈阳性

15精选PPT急性粒细胞白血病（M2a)的POX染色15精选PPT急性淋巴细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性

16精选PPT急性淋巴细胞白血病的POX染色16精选PPT急性早幼粒细胞白血病的POX染色１.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性

17精选PPT急性早幼粒细胞白血病的POX染色17精选PPT急性单核细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性18精选PPT急性单核细胞白血病的POX染色18精选PPT

6、临床意义

（1）正常分布

粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈不同程度阳性。

单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。

淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。1919精选PPT6、临床意义1919精选PPT

（2）急性白血病的鉴别诊断

幼稚细胞POX阳性率≥3%：急非淋（AML)

幼稚细胞POX阳性率＜3%：急淋（ALL)

2020精选PPT（2）急性白血病的鉴别诊断2020精选PPT

（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色

（偶氮偶联法）1.原理磷酸奈酚钠磷酸+萘酚

偶联萘酚+重氮盐不溶性有色沉淀物定位于胞浆(坚固蓝RR盐)

21NAPPH9.2～9.821精选PPT（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色

222.试剂（1）固定剂：10％甲醛甲醇溶液（2）Tris-Hcl缓冲液的配制：Tris粉〔三胺基甲烷〕4.85克溶于200ml蒸馏水中,加浓HCL1-2滴，PH调至9.2，4℃保存！（3）作用(基质液):磷酸萘酚钠5mg

N-N二甲基酰胺1ml

Tris-Hcl液4ml

坚固蓝RR盐5mg

（4）复染液：1%中性红22精选PPT222.试剂22精选PPT

3.操作步骤

1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片（标本片及对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干；2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干；3、1%中性红复染1min2323精选PPT3.操作步骤2323精选PPT4.注意事项

(1)重氮盐以坚固蓝RR盐为最佳；(2)坚固蓝RR盐应适量：过多易造成染色失败，过少使反应减弱；(3)每次都要做阳性对照；(4)作用液新鲜配制，配好后要立即使用2424精选PPT4.注意事项2424精选PPT

5.结果观察:(对照片成熟中性粒细胞中出现棕黑色颗粒为阳性细胞，说明染色成功)正常人除成熟中性粒细胞NAP可见阳性外，其它血细胞均为阴性。且正常阳性率＜40%，积分值30～130分。

2525精选PPT5.结果观察:(对照片成熟中性粒细胞中出现棕黑色颗粒为阳6.NAP阳性结果及积分判断标准“－”0分，胞浆中无阳性颗粒“+”1分，胞浆中含有少量颗粒“2+”2分，胞浆中含有中等量颗粒“3+”3分，胞浆中含有丰富的颗粒，但胞核清楚“4+”4分，胞浆中含有丰富粗大的颗粒，但胞核不清楚26精选PPT6.NAP阳性结果及积分判断标准“－”0分，胞浆中无阳性中性粒细胞碱性磷酸酶染色1.中性成熟粒细胞（+）；2.中性成熟粒细胞（++）；3.中性成熟粒细胞（+++）；4.中性成熟粒细胞（++++）；5.淋巴细胞（-）27精选PPT中性粒细胞碱性磷酸酶染色27精选PPT2828精选PPT2828精选PPT29NAP分级29精选PPT29NAP分级29精选PPT

7.临床意义

增高：细菌感染、类白、AA、急淋、慢粒急变、骨髓增殖性疾病，恶性淋巴瘤。

降低：慢粒、急粒、PNH、MDS、恶组3030精选PPT7.临床意义3030精选PPT

8.鉴别诊断

慢粒与类白：前↓；后↑。PNH与AA：前↓；后↑。

急粒与急淋：前↓；后↑。MDS与慢性再障：前↓；后↑。病毒感染与细菌感染：前者无明显变化，后者↑。恶组与反应性组织细胞增多：前↓；后↑。

3131精选PPT8.鉴别诊断3131精选PPT（三）酯酶染色概述特异性酯酶染色非特异性酯酶染色32精选PPT（三）酯酶染色概述32精选PPT

概述

根据各类细胞所含酯酶特异性高低分为特异性酯酶(SE)和非特异性酯酶(NSE)；特异性酯酶是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）；非特异性酯酶根据水解基质液的PH不同，又分为中性NSE（α-醋酸萘酚酯酶

），酸性NSE（酸性α-醋酸萘酚酯酶），碱性NSE（α-丁酸萘酚酯酶）。目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCE和α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）+NaF抑制试验。33精选PPT概述根据各类细胞所含1.原理（偶氮偶联法）氯乙酸AS－D萘酚AS－D萘酚

+重氮盐(坚固蓝B盐)34NAS-DCE不溶性有色沉淀物定位于胞浆内酶所在位特异性酯酶(CE)染色基质液基质液34精选PPT1.原理（偶氮偶联法）34NAS-DCE不溶性有色沉淀物定位

2.试剂：

（1）固定液：10％甲醛甲醇溶液（2）作用液（基质液）氯乙酸AS－D萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸盐缓冲液19ml

坚固蓝B盐10mg（3）复染液：1%中性红

3535精选PPT2.试剂：

3.染色方法（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干（2）滴加作用液37℃孵育30min，水洗（3）1%中性红复染1min，水洗晾干镜检。3636精选PPT3.染色方法3636精选PPT

4.注意事项：

1.氯乙酸AS-D萘酚溶液应避光，4℃冰箱保存，变黄或混浊即失效。

2.染色温度37℃效果最好3737精选PPT3737精选PPT5.结果判断

中性分叶核粒细胞胞浆中见细小，弥漫分布的蓝色颗粒为染色成功的标志。6.临床意义

粒系除早期原粒外，其余阶段细胞均为阳性，其它各系均为阴性。CE染色对粒细胞白血病有特异性的诊断价值。3838精选PPT5.结果判断3838精选PPT39CE39精选PPT39CE39精选PPT

非特异性酯酶染色（α-NAE）1.原理：α-醋酸萘酚α-萘酚重氮盐40α-NAE形成不溶性有色沉淀定位于胞浆内酶所在位置7.4~7.6(坚固盐B)40精选PPT非特异性酯酶染色（α-NAE）1.原理：4

2.试剂（1）固定液：甲醛（2）作用液:

α-醋酸萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸盐缓冲液10ml固蓝B盐10mg

（3）复染液：10g/L甲基绿水溶液4141精选PPT2.试剂4141精选PPT423.染色步骤（1）甲醛蒸气固定5-10min，流水冲洗5min晾干（2）放入作用液37℃1h,流水冲洗。（3）10g/L的甲基绿溶液复染5min,水洗待干镜检

（4）NaF抑制试验：在40ml作用液中加NaF15mg同样染色后，油镜计数100个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率和积分，按公式计算出抑制率，正常小于50%。42精选PPT423.染色步骤42精选PPT

A图：急性单核细胞白血病α-NAE染色

原始、幼稚单核细胞多呈强阳性

B图：急性单核细胞白血病

α-NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）

A

B43精选PPTA图：急性单核细胞白血病α-NAE染色B图：急性单核细胞

4.结果判断：胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性

染色成功指标：正常部分原始、幼稚及成熟单核细胞呈阳性；部分粒细胞为弱阳性反应；部分成熟淋巴或个别中、晚幼红呈阳性。

4444精选PPT4.结果判断：胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性44444545精选PPT4545精选PPT

5.临床意义：鉴别急性白血病

（1）急单时，原始至成熟单核大多为α-NAE阳性，且易被NaF抑制，抑制率正常大于50%。

（2）急粒时，白血病细胞多呈阴性或弱阳性，M3呈阳性，但均不被NaF抑制。

酯酶双染：同一张血涂片上的细胞分别在两种不同的基质液中作用一定时间，复染镜检。主用于鉴别诊断AML-M4亚型。

4646精选PPT5.临床意义：鉴别急性白血病

（1）急单时，原始至成熟骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应。47精选PPT骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染（四）糖原染色(PAS)细胞内糖原中的乙二醇基48氧化过碘酸二醛基

1.原理（过碘酸-雪夫氏反应）二醛基经过加成和缩合使无色亚硫酸品红恢复品红的红色失去亚硫酸定位于含有糖原的细胞内48精选PPT（四）糖原染色(PAS)细胞内糖原中的乙二醇基48氧化2.试剂

（1）10g/L的过碘酸氧化剂⑵雪夫氏试剂（schiff）：红色品红与偏重亚硫酸钠，变成了无色品红。

⑶20/L甲基绿复染液4949精选PPT2.试剂4949精选PPT3.操作

（1）新鲜髓片放在95％乙醇中固定10分钟；蒸馏水冲洗待干；（2）10g/L过碘酸氧化15分钟；蒸馏水冲洗；（3）置雪夫氏试剂浸泡45分钟，水洗后凉干；（4）甲基绿复染15分钟，水洗待干镜检。

5050精选PPT3.操作5050精选PPT

4.注意事项

（1）所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。（2）雪夫氏染液应避光密封保存，变红则失效。（3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸馏水洗涂片，而且一定要完全干燥，若有水，试剂变色失效。5151精选PPT4.注意事项5151精选PPT

（4）染色时间和温度应相对恒定，一般37℃效果最好。（5）染好的标本不能久放，8天后渐退色，因此应及时观察。5252精选PPT（4）染色时间和温度应相对恒定，一般37℃效果最好。525

5.结果观察

阳性：细胞浆内的红色阳性物呈弥散状、颗粒状或块状，胞核染绿色。阴性：胞浆无色或无红色颗粒。

5353精选PPT5.结果观察5353精选PPT

6.临床意义

正常血细胞的染色反应（1）粒系：原始细胞多为阴性，随着细胞成熟，阳性逐渐增强。（2）淋系：正常人阳性率10-50%之间，多为20%以下。（3）红系：PAS呈阴性反应（4）巨核：PAS呈阳性反应（5）单核系:呈阴性或细颗粒状弱阳性。5454精选PPT6.临床意义5454精选PPT正常血细胞PAS染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（+）3.中性中幼粒细胞（++）4.中性晚幼粒细胞（+++）5.中性杆状核粒细胞（++++）6.中性分叶核粒细胞（++++）

7.嗜碱性粒细胞（+++）8.嗜酸性粒细胞（+++）9.单核细胞（±）

10.淋巴细胞（++++）55精选PPT正常血细胞PAS染色55精选PPT

疾病鉴别

（1）红细胞系统疾病：M6、MDS呈阳性（均匀或块状红色）；巨幼贫、再障呈阴性。

（2）白血病：急淋及慢淋：粗颗粒或块状阳性急粒：阴性或弱阳性（弥散细颗粒）急单：阳性，多为细颗粒有时可见粗颗粒急性巨核细胞白血病：阳性（块状）

5656精选PPT疾病鉴别5656精选PPTPASAML-M6幼红细胞呈阳性反应MA幼红细胞呈阴性反应57精选PPTPASAML-M6MA57精选PPT急性淋巴细胞白血病PAS染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性58精选PPT急性淋巴细胞白血病PAS染色58精选PPT59急淋PAS阳性细胞59精选PPT59急淋PAS阳性细胞59精选PPT60PAS阳性的幼红细胞60精选PPT60PAS阳性的幼红细胞60精选PPT

1.原理(普鲁氏蓝反应)4Fe3++K4[Fe(CN)6]Fe4[Fe(CN)6]3+12K+

(亚铁氰化钾)(蓝色亚铁氰化铁)61（六）骨髓铁染色

稀盐酸细胞外铁：主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中细胞内铁：主要存在于有核红细胞中61精选PPT1.原理(普鲁氏蓝反应)61（六）骨髓铁染色稀盐酸细胞外

2.试剂

（1）固定液：甲醇

（2）酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾5份，浓盐酸1份。取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓慢加入浓盐酸，边滴边摇由开始的白色沉淀消失为至。

（3）复染剂：0.5%沙黄

6262精选PPT2.试剂6262精选PPT

3.操作步骤

（1）选片做标记，甲醇固定10min

（2）37℃滴加酸性亚铁氰化钾溶液染色30min

（3）蒸馏水冲洗2min后沙黄复染1min，待干镜检。

6363精选PPT3.操作步骤6363精选PPT4.注意事项（1）所用的玻片及器具必须清洁，无铁污染。（2）应选有骨髓小粒的髓片做铁染色，以便观察细胞外铁。（3）作用液必须新鲜配制。（4）亚铁氰化钾暴露于空气中，易氧化变质，贮于棕色瓶中，避光密封保存。

6464精选PPT4.注意事项6464精选PPT

（5）复染前应充分冲洗，否则铁粒状结晶过多，影响观察。（6）计数时要不停地旋转细螺旋器，因为铁粒在细胞内的高低度不一致，每看一个中、晚幼红细胞要旋转几次，直到看清为止。（7）观察内铁时，幼红及淋巴细胞要分清，幼红细胞核为鲜红色，淋巴细胞核为淡红色，（8）与污染铁的鉴别：污染铁不在髓小粒和细胞内，而是浮在上边，而且蓝中带黑。6565精选PPT（5）复染前应充分冲洗，否则铁粒状结晶过多，影响观察。65

5.结果观察：

（1）正常幼红细胞核呈鲜红、浆淡黄、铁颗粒呈蓝绿色（2）低倍镜观察细胞外铁：涂片尾部和髓小粒附近阴性：无蓝绿色铁粒。阳性：含有不同程度的铁粒、铁小珠、铁小块。根据阳性程度不同分四级。

6666精选PPT5.结果观察：6666精选PPT67细胞外铁——幼红细胞外的骨髓铁

(+)少量铁粒

偶见铁小珠

（2＋）

较多铁粒较多铁小珠

(3+)许多铁粒许多铁小珠少量小块状。

(4+)极多的铁颗粒

铁小珠

许多小块密集

成堆。67精选PPT67细胞外铁——幼红细胞外的骨髓铁(+)细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀68精选PPT细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀68精选PPT（3）细胞内铁：油镜计数100个中晚幼红细胞；并记录含有蓝色颗粒的铁粒幼红细胞百分率。Ⅰ型胞浆内1-2个铁小粒Ⅱ型胞浆内3-5个铁小粒Ⅲ型胞浆内6-10个铁小粒或1-4粗大颗粒Ⅳ型含铁小粒10个以上或5个以上粗大颗粒

环形铁粒幼红细胞：含铁粒在6粒以上，其中2/3以上铁粒围绕核排列，超过1/2周。6969精选PPT（3）细胞内铁：油镜计数100个中晚幼红细胞；并记696骨髓细胞内铁染色1.环形铁粒幼红细胞；2.铁粒幼红细胞

70精选PPT骨髓细胞内铁染色70精选PPT7171精选PPT7171精选PPT

5.正常参考值

细胞外铁：+～++（2/3为+，1/3为++）细胞内铁：20%～40%（正常人Ⅰ型多见，少数为Ⅱ型）7272精选PPT5.正常参考值7272精选PPT7.临床意义：

(1)缺铁性贫血:外铁↓或(－)，内铁＜15%。此方法是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；经铁剂治疗后细胞内外铁迅速增多。(2)铁粒幼细胞性贫血：内铁阳性率高于40%，可达70%以上，铁粒数目增多，颗粒粗大，可见环铁；外铁多为+2，可达+3～+4。（3）MDS-RAS：内铁阳性率↑，环铁＞15%。7373精选PPT7.临床意义：7373精选PPT（4）感染性贫血：外铁↑，内铁↓（5）地中海贫血：内铁↑，外铁↑（6）巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再障、白血病：外铁、内铁正常或升高。7474精选PPT（4）感染性贫血：外铁↑，内铁↓7474精选PPT三、临床应用75精选PPT三、临床应用75精选PPT

对于贫血病例铁染色应作为常规染色外铁↓或(-)，内铁↓：在缺铁性贫血。

内、外铁正常或增多：巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血。外铁增多，内铁减少：感染性贫血、肝病性贫血、肾病性贫血。内、外铁均增多：增生异常综合症（MDS）、铁粒幼细胞性贫血。76一、在贫血诊断中的应用76精选PPT对于贫血病例铁染色应作为常规染色76一、在贫血诊断

在巨幼细胞性贫血和红血病或红白血病，作PAS染色。

阵发性睡眠性血红蛋白尿骨髓增生减低者与再生障碍性贫血，N