蛋白质的分离纯化和表征课件

第七章蛋白质的分离、纯化和表征2009.7.290第七章蛋白质的分离、纯化和表征2009.7.2901主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和方法分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力第7章蛋白质的分离、纯化和表征主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和方法第7章蛋白质的2三、蛋白质相对分子质量的测定

一、蛋白质的重要性质

二、蛋白质的分离纯化四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定三、蛋白质相对分子质量的测定一、蛋白质的重要性质

二、蛋3

一、蛋白质的重要性质

1、两性解离性质及等电点2、蛋白质胶体性质3、蛋白质的沉淀4、蛋白质的变性与复性5、蛋白质的紫外吸收特性6、蛋白质的呈色反应一、蛋白质的重要性质

1、两性解离性质及等电点41.蛋白质的两性解离性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

1.蛋白质的两性解离性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可5对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点(pI)；蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相6没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点（isoionicpoint）等离子点是蛋白质的一个特征常数没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子7电泳沉淀电泳沉淀8胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性蛋白质是高分子化合物，由于分子量大，它在水溶液中所形成的颗粒直径约为1－100nm。2.蛋白质的胶体性质胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以92.蛋白质的胶体性质*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜（0.3-0.5g/gPr)表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化膜这些颗粒带有电荷2.蛋白质的胶体性质*蛋白质胶体稳定的因素表面分布着大量10+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质胶体的稳定+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白113.蛋白质的沉淀如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。

沉淀:不稳定的蛋白质从溶液中析出结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱凝固：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性3.蛋白质的沉淀如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等12+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白13沉淀方法类别:1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）2、酸硷（等电点沉淀）3、有机溶剂沉淀4、重金属盐类沉淀5、生物碱试剂和某些酸类沉淀6、加热变性沉淀沉淀的蛋白质不一定变性变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是变性深刻化体现变性沉淀沉淀方法类别:沉淀的蛋白质不一定变性变性沉淀14某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性4.蛋白质变性与复性

结构功能高级结构破坏生理功能丧失某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质154.蛋白质变性与复性

变性的可逆性可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。复性（renaturation）蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程胃蛋白酶加热至80℃－90℃时，变性、无消化蛋白质的能力，失去溶解性。如将温度下降到37℃，就复性，又恢复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性时间加长，条件加剧，变性程度加深，就成为不可逆变性。4.蛋白质变性与复性

变性的可逆性复性（renatura165.蛋白质的紫外吸收光谱

蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。测定范围：0.1～0.5mg/ml5.蛋白质的紫外吸收光谱蛋白质在远紫外光区（200-176.蛋白质主要呈色反应

双缩脲反应酚试剂法

→蛋白质定量、定性

茚三酮反应测定常用方法考马斯亮蓝反应

6.蛋白质主要呈色反应双缩脲反应18双缩脲反应

蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液)Cu2+CuSO4180℃双缩脲反应蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应19Lorry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。Folin－酚试剂法Lorry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种20茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。茚三酮反应(ninhydrinreaction)21操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝法(Bradford法

)1976年Bradford建立操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量考马斯亮蓝22(三)盐析和有机溶剂沉淀(四)电泳(一)透析和超滤(五)层析溶解度两性解离性质分子大小（胶体性质）吸附性质对配体分子的生物学亲和力(二)凝胶过滤分子大小2009.7.290(三)盐析和有机溶剂沉淀(四)电泳(一)透析和超23二、蛋白质的分离纯化(一)根据蛋白质分子大小不同(二)利用溶解度差别(三)根据电荷不同(四)利用选择性吸附透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤电泳、离子交换层析羟磷灰石层析、疏水作用层析等电点沉淀和pH控制、盐溶和盐析、有机溶剂分级分离法、(五)利用对配体的特异生物学亲和力二、蛋白质的分离纯化(一)根据蛋白质分子大小不同(二)利用24蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specificactivity），以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性（以活力单位数/克蛋白质表示）。设法除去变性的和不要的蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量达到最高值。分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级分离和细分级分离3步。目标与原则蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活25（一）根据蛋白质分子大小不同磁力搅拌器磁棒透析液蛋白质溶液半透膜袋1、透析和超滤利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质分开。玻璃纸、火棉纸灯<1nm（一）根据蛋白质分子大小不同磁力搅拌器磁棒透析液蛋白质溶液半26透析工作图半透膜原理渗透压的平衡透析工作图半透膜原理渗透压的平衡27图7-6利用压力和离心力的超过滤滤膜抽气施加外力利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤(超滤)。图7-6利用压力和离心力的超过滤滤膜抽气施加外力利用28解决的是有或无的问题，未能解决大小的问题！解决的是有或无的问题，未能解决大小的问题！292.密度梯度（区带）离心介质：蔗糖、氯化铯、聚蔗糖（Ficoll)、葡聚糖等滴加样品4%8%12%16%20%2.密度梯度（区带）离心介质：蔗糖、氯化铯、聚蔗糖（Fico303、凝胶过滤——分子排阻根据分子大小分离混合物最有效的方法之一多孔网状结构（微孔）交联度（孔度）凝胶珠（颗粒）3、凝胶过滤——分子排阻根据分子大小分离混合物最有效的方法之31凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围（fractionationrange）SephadexG-50排阻极限是30000排阻极限（exc1usionlimit）来表示分级分离范围的上限，它被定义为不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的MrSephadexG-75

排阻极限是70000凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围（fr32分子筛层析分子筛层析33按照分子量大小分离开按照分子量大小分离开341、等电点沉淀和pH控制(二)利用溶解度差别溶解度（蛋白mg/ml）1、等电点沉淀和pH控制(二)利用溶解度差别溶解度（蛋白mg35在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响离子强度（I）Log（溶解度）盐溶：中性盐低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度。盐析：当蛋白质溶液的离子强度增加到一定强度后，很多蛋白质可以从溶液中沉淀下来。2、盐溶和盐析在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影36常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠作用原理:降低水的活度WaterActivity，水化层脱水，表面疏水基团暴露并相互作用引起聚集特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠作用原理:降低水的活度W373、有机溶剂沉淀法降低溶液的介电常数：使蛋白质表面可解离基团的离子化程度减弱，有机溶剂脱去水化层，致蛋白质分子聚集而沉淀。必须在低温下操作注意事项:尽量缩短处理的时间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇、乙醇、丙酮缺点：原理常用有机溶剂:常会使蛋白质变性介电常数大的溶剂，有利于离子对的解离。

80－303、有机溶剂沉淀法降低溶液的介电常数：使蛋白质表面可解离基团38（三）根据电荷不同1、电泳：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向移动称为电泳。（三）根据电荷不同1、电泳：带电颗粒在电场中向着所带电荷相39影响泳动速度的因素：

A、电荷多少B、分子形状大小C、电场强度影响泳动速度的因素：40经典：自由电泳或称移动界面电泳样品经典：自由电泳或称移动界面电泳样品41区带电泳根据支持物的物理性质分为：①滤纸电泳和薄膜电泳②粉末电泳：淀粉、纤维素功硅胶粉等③细丝电泳：人造丝、尼龙丝等细丝支持物上的电泳④凝胶电泳：最常用的有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带

区带电泳根据支持物的物理性质分为：指有支持介质的电泳，待42水平式平板凝胶电泳水平式平板凝胶电泳43垂直式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳44SDS-凝胶电泳谱在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关测定单体蛋白质分子量SDS-凝胶电泳谱在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠S45等电聚焦（IEF）电泳蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行的pH梯度制作一般利用两性电解质在外电场作用下，自然形成pH梯度。等电聚焦（IEF）电泳蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如46毛细管电泳电泳是在微内径管(一般为50um内径和300um外径)中进行记录仪毛细管毛细管电泳电泳是在微内径管(一般为50um内径和300um外472、离子交换层析

阳离子交换层析阴离子交换层析2、离子交换层析48带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱阳离子交换树脂工作示意图带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱阳离子交换树脂49蛋白质的分离纯化和表征课件50蛋白质的分离纯化和表征课件51(四)利用选择性吸附1．羟磷灰石层析吸附剂羟磷灰石（hydroxylapatlde）即结晶磷酸钙[Ca10(PO4)6(OH)2]它用于分离蛋白质或核酸羟磷灰石层析最重要的用途之一是把单链DNA和双链DNA分开

2．疏水作用层析疏水吸附剂有苯基琼脂糖（phenyl-sephadex），辛基琼脂糖（octa-sephadex）等(四)利用选择性吸附1．羟磷灰石层析52亲和层析工作示意图蛋白质载体介质配体结合洗脱洗脱介质(五)利用对配体的特异生物学亲和力亲和层析工作示意图蛋白质载体介质配体结合洗脱洗脱介质(五)利53蛋白质的分离纯化和表征课件54附：高效液相层析和快速蛋白液相层析反相HPLC：固定相是非级性的，而流动相是相对极性的固定相——由烷基硅烷与硅石通过化学反应连接而成快速蛋白液相层析附：高效液相层析和快速蛋白液相层析反相HPLC：固定相是非级55三、蛋白质相对分子质量的测定凝胶过滤法测定相对分子质量SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定

相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量如：肌红蛋白的含铁量为0.335%，计算肌红蛋白的最低分子量。三、蛋白质相对分子质量的测定凝胶过滤法测定相对分子质量SDS56凝胶过滤法测定相对分子质量利用凝胶过滤（gelfiltration）可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。这种方法比较简便，不要求复杂的仪器就能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径凝胶过滤法测定相对分子质量利用凝胶过滤（gelfiltr571966年Andrews根据他的实验结果提出了一个经验公式VeV0=a-blogMr移项上式得logMr=ab1bVeV0-洗脱体积外水体积内水体积1966年Andrews根据他的实验结果提出了一个经验公式58图7-4洗脱体积与相对分子质量的关系VelogMrlogMr=ab1bVeV0-图7-4洗脱体积与相对分子质量的关系VelogMrlog59洗脱曲线logMr洗脱曲线logMr60SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定

相对分子质量电泳时，大分子的迁移率决定于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率（e1ectrophoreticmobility）主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定

相对分子质量电泳时，大分子的61SDS在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS／l克蛋白质，相当于每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。SDS与蛋白质的结合：第一，由于SDS是阴离子，使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合体，电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动。第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度（直径）都是一样的约为1.8nm，而长轴长度则随蛋白质的相对分子质量成正比例变化SDS在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为62电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系a和b、K1和K2都是常数以几种相对分子量已知的标准蛋白质的Mr的对数值对μR作图，根据待测样品的μR，从其标准曲线上查出分子量logMr=a-bμR

或logMr=K1–K2μR

μR=样品迁移距离前沿（染料）迁移距离电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系a和b、K1和63SDS-凝胶电泳谱SDS-凝胶电泳谱64四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定（一）蛋白质含量测定1.凯氏定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定（一）蛋白质含量测定65若以甘氨酸为例，其反应式如下：

CH2COOH

|

+3H2SO4

2CO2+3SO2+4H2O+NH3

(1)

NH2

2NH3+H2SO4

(NH4)2SO4

(2)

(NH4)2SO4+2NaOH

2H2O+Na2SO4+2NH3

(3)

若以甘氨酸为例，其反应式如下：66反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装672.双缩脲法（Biuret法）

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。于540nm处进行比色测定。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。2.双缩脲法（Biuret法）683.Folin—酚试剂法（Lowry法）

Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。3.Folin—酚试剂法（Lowry法）694.考马斯亮兰法（Bradford法）

考马