骨骼肌微损伤自体修复中蛋白质组的作用

骨骼肌微损伤自体修复中蛋白质组的作用

离心运动引起的骨关节损伤是骨关节肌肉损伤的常见类型，通常伴有骨关节肌肉肌力的下降、疼痛和收缩。这是影响运动员强度训练的重要因素之一。1材料和方法1.1运动动物分组5周龄雄性Wistar大鼠[许可证号:SCXK(鲁)20090001],由山东大学实验动物中心提供,在山东体育学院运动人体科学重点实验室动物房饲养,随机分为安静对照组(D组)、运动后即刻组(0h组)、运动后24h组(24h组)、运动后48h组(48h组)、运动后72h组(72h组)及运动后168h组(168h组),每组6只,共计36只。D组不进行针对性大强度离心运动,其余组大鼠一次大强度离心运动方案参照葛新发方法进行1.2样品冲洗和染色取处死大鼠股四头肌并切为直径1mm左右块状样品,于3.5%戊二醛中固定过夜,用0.1M磷酸缓冲液(pH=7.2)间隔20min冲洗,共冲洗5次,随后经1%锇酸固定4h,再次重复上述冲洗步骤,乙醇脱水。采用Epon812树脂对样品进行浸透、包埋、聚合并切片(LKB超薄切片机),3%醋酸铀-柠檬酸铅对样本进行染色。JEM—1200EX透射电子显微镜及成像系统(JEOL,Japan)观察并拍照片,分析不同组别骨骼肌的超微结构1.3关于蛋白质样品的制备和电泳取股四头肌样品200mg,经蛋白质提取、真空干燥后用Bradford法定量1.4透射扫描系统采用GS-710光密度仪256色灰度和600DPI分辨率对考马斯亮蓝染色后的电泳凝胶进行透射扫描。扫描后利用Imagemaster2DplatinumV5.0软件对蛋白质表达谱进行点检测、背景消减,建立平均凝胶后进行匹配、量化获取斑点的相关信息处理。以D组电泳图谱作参考,进行特异蛋白质表达量分析并对表达受到激活或者抑制的蛋白质进行进一步质谱鉴定。1.5查询数据分析利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对表达量具有显著性差异的蛋白质进行分析,通过Mascot搜索引擎进行查询相关质谱数据与已有蛋白质匹配情况,蛋白质信息经NCBIProtein数据库进行查询。查询参数主要包括:物种来源鼠;胰蛋白质酶水解;酶解片段不完全选择为1;肽片段相对分子质量最大允许误差控制在±0.1Da。1.6统计分析用ImageMaster2DPlatinumV5.0分析软件检验差异蛋白点相对含量的差别是否有统计学意义。2研究结果2.1外膜及趋势组织对照组在无运动刺激情况下,肌细胞核、肌节、肌纤维、线粒体、内质网清晰(见图1a)。运动后即刻,大鼠股四头肌肌细胞核及肌节清晰可见,无明显变化,Z线清晰,基本未发现肌丝溶解;线粒体基本正常,未发现明显肿胀(见图1b)。运动后24h,部分肌节紊乱甚至消失,Z线断裂,肌丝溶解;线粒体遭到严重破坏,出现高度水肿,嵴开始溶解,出现空泡化现象,外膜不完整;内质网模糊;细胞膜出现局部溶解现象(见图1c)。运动后48h,肌节明显萎缩;线粒体有受损迹象,但其结构逐渐清晰,外膜和嵴已显现(见图1d)。运动后72h,I带出现过度收缩现象,肌节清晰,Z线逐渐清晰;线粒体数量基本恢复,但外膜未完全修复(见图1e)。运动后168h,细胞核恢复,Z线清晰可见,明暗带分明,肌节清晰;线粒体数量进一步恢复,线粒体空泡化基本消失(见图1f)。2.2大强度离心运动后，蛋白质组的差异2.2.1iii类蛋白质经分析发现一次大强度离心运动后即刻,大鼠股四头肌蛋白质组表达谱中49种蛋白质出现显著性差异(图2)。其中,44种蛋白质表达量上调,表观等电点为pH4.3~6.2,表观分子量为25~64kDa;5种蛋白质表达量下调,表观等电点为pH4.9~6.0,表观分子量为23~66kDa。经质谱鉴定得到22种特异蛋白质信息中(表1),I类蛋白质4种,其中血色素结合蛋白(hemopexin)、3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvatesulfurtransferase)及6-磷酸葡糖酸内酯酶(6-phosphogluconolactonase)3种蛋白质表达上调2.9~24.7倍;3-羟基异丁酸脱氢酶(3-hydroxyisobutyratedehydrogenase)表达量下调至对照组的0.53倍。II类蛋白质13种(占特异蛋白质总数的58.3%),其中维生素D结合蛋白(vitaminDbindingprotein)、膜联蛋白A5(AnnexinA5)、α1抗胰蛋白酶前体(alpha-1-antitrypsinprecursor)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、热休克蛋白β1(heatshockproteinbeta-1)、着丝粒关联蛋白E(Centromere-associatedproteinE)、α2-HS-糖蛋白(alpha-2-HS-glycoprotein)、乙酰水解酶(Platelet-activatingfactoracetylhydrolaseIB)及免疫球蛋白λ轻链蛋白质(immunoglobulinlambdalightchain)表达量上调2.0~12.0倍之间;III类蛋白质6种,其中,膜联蛋白A5和Trim72蛋白(Tripartitemotifcontainingprotein72)表达量分别上调2.6倍和4.1倍,核糖体蛋白(39Sribosomalprotein)表达量下调至0.32倍;IV类蛋白质2种,包括角蛋白9(keratin9)。2.2.2iii类蛋白质相关蛋白表达情况一次大强度离心运动后24h,大鼠股四头肌蛋白质组表达谱中64种蛋白质出现显著性差异(图3)。其中,39种蛋白质表达量上调,表观等电点在pH4.2~6.5,表观分子量在25~110kDa;25种蛋白质表达量下调,表观等电点在pH4.1~6.8,表观分子量在21~86kDa。经质谱鉴定得到25种特异蛋白质信息中(表2),I类蛋白质11种,其中辅酶Q9(Coq9protein)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADHdehydrogenase)、乙酰基转移酶(acetyltransferase)、异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase)、磷酸甘油-3脱氢酶(glycerol-3phosphatedehydrogenase[NAD(+)])、血色素结合蛋白表达上调2.3~3.9倍,磷酸丙糖异构酶(Triosephosphateisomerase)、腺苷酸激酶同工酶1(Adenylatekinaseisoenzyme1)、Tpi1蛋白(Tpi1protein,partial)、磷酸乙醇酸磷酸酶(phosphoglycolatephosphatase)表达量下调至对照组0.32~0.56倍;II类蛋白质10种,其中蛋白酶体(26Sproteasomenon-ATPaseregulatorysubunit6)、免疫球蛋白λ轻链、胞内氯离子通道蛋白1(Chlorideintracellularchannelprotein1)、葡萄糖调节蛋白(glucose-regulatedprotein)及磷酸酶2C蛋白(Ppm2cprotein)表达量上调1.9~4.7倍,过氧化物酶体双功能酶(peroxisomalbifunctionalenzyme)、磷酸乙醇酸磷酸酶和乙基丙二酸脑病蛋白(proteinETHE1)3种蛋白质表达量下调至0.30~0.56倍;Ⅲ类蛋白质5种,其中,胞内氯离子通道蛋白1表达量上调1.9倍,核糖体蛋白和过氧化物酶体双功能酶表达量下调分别至0.37和0.30倍;Ⅳ类蛋白质4种,包括蛋白FAM195B。2.2.3种特异性蛋白质信息一次大强度离心运动后48h,大鼠股四头肌蛋白质组表达谱中41种蛋白质出现显著性差异(图4)。其中,33种蛋白质表达量上调,表观等电点在pH4.6~6.8,表观分子量在22~69kDa;8种蛋白质表达量下调,表观等电点在pH4.9~6.8,表观分子量在20.1~55kDa。经质谱鉴定得到16种特异蛋白质信息中(表3),I类蛋白质6种,其中异柠檬酸脱氢酶、血色素结合蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、葡萄糖调节蛋白及乙酰基转移酶共5种蛋白质表达上调2.1~3.4倍,腺苷酸激酶同工酶1表达量下调至对照组0.26倍;II类蛋白质7种,其中蛋白酶体β6、已异戊二烯二羟安息香酸甲基转移酶(hexaprenyldihydroxybenzoatemethyltransferase)、维生素D结合蛋白、磷酸酶2C蛋白及结合珠蛋白前体(haptoglobinprecursor)共5种蛋白质表达量上调2.0~4.9倍,热休克蛋白β-2(heatshockproteinbeta-2)和热休克蛋白β-1共2种蛋白质表达量下调至0.56倍和0.37倍;III类蛋白质4种,Trim72蛋白(Tripartitemotif-containingprotein72)、Ⅱ型细胞骨架1角蛋白(Keratin)、维生素D结合蛋白表达量上调3.4~5.6倍,核糖体蛋白表达量下降至0.63倍。2.2.4人才培养信息检测一次大强度离心运动后72h,大鼠股四头肌蛋白质组表达谱中36种蛋白质出现显著性差异(图5)。其中,32种蛋白质表达量上调,表观等电点在pH4.3~6.2,表观分子量在27~59kDa;4种蛋白质表达量下调,表观等电点在pH4.6~6.2,表观分子量在20.1~29kDa。经质谱鉴定得到18种特异蛋白质信息中(表4),I类蛋白质6种,其中异柠檬酸脱氢酶、乙酰基转移酶、血色素结合蛋白、辅酶Q9和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶共5种蛋白质表达上调2.4~4.0倍,磷酸丙糖异构酶表达量下调至对照组的0.30倍;II类蛋白质5种,其中维生素D结合蛋白、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、磷酸酶2C蛋白及鸟嘌呤脱氨酶(guaninedeaminase)表达量上调2.8~6.9倍;Ⅲ类蛋白质7种,胎球蛋白A、核糖体蛋白、维生素D结合蛋白、肌球蛋白1/3轻链(myosinlightchain)、载脂蛋白A-I前蛋白原(apolipoproteinA-Ipreproprotein)、鸟嘌呤脱氨酶及内质网驻地蛋白29(endoplasmicreticulumresidentprotein29)表达量上调1.8~4.1倍。2.2.5种常见蛋白质表达量和形态鉴定一次大强度离心运动后168h,大鼠股四头肌蛋白质组表达谱中16种蛋白质出现显著性差异(图6)。其中,11种蛋白质表达量上调,表观等电点在pH4.1~6.5,表观分子量在25~57kDa;5种蛋白质表达量下调,表观等电点在pH4.6~6.2,表观分子量在22~38kDa。经质谱鉴定得到7种特异蛋白质信息中(表5),I类蛋白质中异柠檬酸脱氢酶和辅酶Q9蛋白质表达分别上调2.3和3.3倍,腺苷酸激酶同工酶1表达量下调至对照组0.33倍;Ⅲ类蛋白质3种,其中肌钙腔蛋白、3-巯基丙酮酸硫基转移酶及鸟嘌呤脱氨酶表达量上调2.5~3.8倍;Ⅲ类蛋白质和Ⅳ类蛋白质中分别有鸟嘌呤脱氨酶和14-3-3ε蛋白表达量分别上调3.8倍和2.3倍。2.2.6蛋白表达情况差异一次大强度离心运动后即刻至1周之内,蛋白质表达主要以上调为主,蛋白质表达下调主要在运动后24~48h之间(图7)。从蛋白质表达种类分析,I类蛋白质差异性表达上调次数为25次,下调表达次数8次,特别是运动后24~48h之间上调表达次数为13次,占上调表达次数的56.5%;Ⅱ类蛋白质在运动后即刻表达上调为主,表达上调蛋白数量为14种,未出现下调表达的蛋白质,随后上调表达蛋白数量逐渐下降,而在24h时出现4个下调蛋白;Ⅲ类蛋白质表达主要体现在48h组和72h组,上调蛋白质数量分别为4种和7种,下调表达蛋白质数量分别为1种和0种。对特异表达蛋白质变化频次分析发现(表6),I类蛋白质中分别有异柠檬酸脱氢酶、血色素结合蛋白、辅酶Q9、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶、乙酰基转移酶在微损伤后24~72h之间表达活跃并以表达量上调为主,腺苷酸激酶同工酶1表达以下调为主;Ⅱ类蛋白质中磷酸酶2C蛋白、热休克蛋白β-1、免疫球蛋白λ轻链、结合珠蛋白前体、维生素D结合蛋白、鸟嘌呤脱氨酶表达频次较高,其中热休克蛋白β-1在0h表达量上调,至48h表达量下降至正常水平的0.37倍,其余蛋白表达量在0h时均有显著上升,在24~72h之间各蛋白表达规律不尽相同,主要以表达上调为主;Ⅲ类蛋白质中核糖体蛋白在0~48h之间表达量出现显著下降,在72h时表达量上调至对照组的2.8倍。3次大强度离心运动后细胞超微结构的变化大强度下坡跑可诱导蛋白质表达水平变化,这种变化与骨骼肌损伤修复过程中炎症消除、肌纤维重建过程密切关联,说明机体对大强度离心运动造成的微损伤能通过机体自身调节进行补偿大鼠骨骼肌超微结构在运动后即刻组中未见有明显变化,说明运动后即刻微损伤尚未完全显现运动后24~72h,骨骼肌中线粒体遭到严重破坏,出现高度水肿,嵴开始溶解,出现空泡化现象,外膜不完整现象逐渐恢复至线粒体嵴逐渐清晰,外膜基本完整,说明这个阶段是损伤骨骼肌亚细胞恢复的主要时期与对照组比较,Ⅲ类蛋白质的表达主要集中在运动后48h和72