m法测定石埋管悬浮培养石埋柏细胞活力条件的研究

m法测定石埋管悬浮培养石埋柏细胞活力条件的研究

序言mtt（t诱导蓝莓），即酪氨酸，四甲基偶氮唑盐，格式c。自从1983年美国学者Mosmam1材料和方法1.1试验材料1.1.11.1.2mtt溶液1.1.3缓冲区缓冲区(1)柠檬酸钠缓冲液(Na1.1.4渗透促进剂二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司产品)和曲拉通(Triton)分别用缓冲液配制成浓度为5%、0.1%的溶液。1.2方法1.2.1石挡证对不同浓度石基柏细胞的tt细胞的tt细胞的分离MTT测定悬浮细胞活力时,取悬浮培养的石刁柏细胞,抽滤除去培养基。取六支试管,各加入2.5ml4‰的MTT溶液和0.5g(鲜重)石刁柏细胞,并分别加入上述6种含有5%二甲基亚砜渗透促进剂的缓冲液各2.5ml,25℃静置于黑暗处处理20h,细胞变成红色,离心去上清液,加入5ml蒸馏水洗去MTT,如此重复3次,再加入4ml酸化异丙醇洗脱剂,置于60℃水浴中充分洗脱1~2次,使细胞完全无色。取上清液,定容到5ml,在UV-9100型分光光度计上以不同的波长测其吸光值,以确定最佳测定波长。1.2.2细胞无机质细胞处理根据以上实验所确定的方法,取六支试管,各加入2.5ml4‰的MTT溶液和0.5g(鲜重)石刁柏细胞,并分别加入上述6种含有5%二甲基亚砜渗透促进剂的缓冲液各2.5ml,25℃静置于黑暗处处理20h,细胞变成红色,离心去上清液,加入5ml蒸馏水洗去MTT,如此重复3次,再加入4ml酸化异丙醇洗脱剂,置于60℃水浴中充分洗脱1~2次,使细胞完全无色。取上清液,定容到5ml,在UV-9100型分光光度计上以1.2.1所确定的波长进行测定,确定最佳缓冲液。1.2.3渗透促进剂的确定根据以上实验所确定的方法,设置三个处理,处理1(Control):Vc-磷酸钠(VcNa1.2.4mtt细胞的体外分离根据以上实验所确定的方法,取两支试管,各加入2.5ml4‰的MTT溶液、0.5g(鲜重)石刁柏细胞、2.5ml1.2.2中所确定的缓冲液以及1.2.3中所确定的渗透促进剂,25℃静置于黑暗处处理20h,细胞变成红色,离心去上清液,加入5ml蒸馏水洗去MTT,重复3次,再分别加入4ml酸化异丙醇洗脱剂,无水乙醇,并置于60℃水浴中充分洗脱1~2次,使细胞完全无色。取上清液,定容到5ml,在UV-9100型分光光度计上以1.2.1所确定的波长进行测定,确定最佳洗脱剂。1.2.5mtt浓度的确定根据以上实验所确定的方法,各取0.5g处于生长延迟期、指数期、稳定期的石刁柏细胞,加入1.2.2所确定的缓冲液以及1.2.3中所确定的渗透促进剂,分别用浓度为0.033‰、0.066‰、0.100‰、0.133‰、0.167‰、0.233‰、0.266‰、0.300‰、0.333‰、0.367‰和0.400‰的MTT溶液25℃静置于黑暗处处理20h,经1.2.4所确定的最佳洗脱剂脱色后,取上清液,定容为5ml,在UV-9100型分光光度计上以1.2.1所确定的波长进行测定。1.2.6mtt对石沟细胞检测能力的分析分别取4×101.2.7训练时间对mtt染色的影响取5ml石刁柏细胞培养液,400r/min离心以收集细胞,并对其活力进行测定,以得出培养过程中的培养中细胞活力的变化规律。1.3mtt溶液鉴定细胞活力采用比色波长560nm,最适缓冲液为柠檬酸钠-Vc缓冲液,渗透促进剂为二甲基亚砜,洗脱剂为酸化异丙醇,0.267‰浓度的MTT溶液鉴定细胞活力。2结果2.1比色波长各种不同缓冲液处理后得到相同的波形,并均在560nm处有一明显吸收峰(图1)。因此,确定在λ=560nm处测定吸光值。2.2缓冲缓冲液体吸收的影响由图2可以看出,在MTT法测石刁柏细胞活力时,用柠檬酸钠-Vc缓冲液(0.1mol/L,pH7.0)较好。2.3在18h内,土壤od值结果如图3所示,处理1的处理时间在12h之内OD值较为稳定,但OD值最低,24h达到最大值;处理2在18h之内OD值最高,而且一直较为稳定,21h达到最大值,以后逐渐降低;处理3在24h之内OD值始终比较稳定,但其OD值一直较低。因此,选用处理2中二甲基亚砜作为渗透促进剂效果最好。2.4无水乙醇洗脱前后od值比较针对同样的实验材料,使用酸化异丙醇洗脱后的OD值为0.809,无水乙醇洗脱后的OD值为0.621。因此,在通过选用这三种洗脱剂对石刁柏细胞活力的检测,发现最佳洗脱剂为酸化异丙醇。2.5不同浓度中稳定期胞od值的比较图5结果显示延迟期细胞在浓度为0.233‰的MTT溶液处理后OD值最大,而在浓度为0.267‰的MTT溶液处理后OD值最小;指数期细胞在以浓度为0.3‰的MTT溶液处理后OD值最大,而在浓度为0.167‰的MTT溶液处理后OD值最小;稳定期细胞在以浓度为0.233‰的MTT溶液处理后OD值最大,而在浓度为0.367‰的MTT溶液处理后OD值最小。当浓度为0.133‰时延迟期.指数期.稳定期三个时期OD值相差最小,适于对未知培养时期的细胞计数;浓度为0.267‰时三个时期OD值相差最大,细胞颜色差异最明显,适于鉴定细胞活力。2.6mtt对石角质细胞活力的检测相关性曲线回归方程y=0.1867×10由图6可见,细胞数量在4×102.7mtt的细胞活力下降如图7所示,在不更换培养基的情况下,1~2d细胞进入延迟期,随着培养时间的增长,细胞数目以指数的方式增加,3~7d时细胞活力达到最大,活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶酶解MTT产生大量蓝紫色结晶状甲瓒颗粒,使其OD值在560nm处达到最大,7d~9d,细胞增长放缓,细胞活力开始下降,因而OD值趋于下滑。9d以后,培养基中养分几乎耗尽,使得死亡细胞的数量大于活细胞的数量,细胞活力严重下降,OD值持续下滑。由此可见,MTT对细胞染色能力与不同生长时期的活细胞数量成线性关系,而且继代培养基也应该在9d之内更换,否则影响细胞活力。2.8酸脱氢酶法淡黄色的MTT被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶分解产生蓝紫色结晶状甲瓒颗粒,聚积在细胞周围和细胞内,聚积的量与活力成正比。其结果见图8。3mtt法的操作条件MTT法是常用的测定细胞活力的方法,但一般用于动物细胞的活力检测,未见到用于测定植物细胞活力,根据本试验结果,只要选择合适的缓冲液、渗透促进剂、洗脱剂、MTT浓度以及处理时间,MTT法同样可以测定植物细胞的活力。测定石刁柏细胞活力的最适条件为比色波长570nm,最适缓冲液为柠檬酸钠-Vc缓冲液,渗透促进剂为二甲基亚砜,洗脱剂为酸化异丙醇,0.267‰浓度的MTT溶液,处理时间为6~15h。MTT法操作的难点是培养后,细胞的培养基要吸干净,否则,残留的蛋白会对MTT有一定的吸附作用,影响准确性。测吸光值要有一定的时间范围,否则在测定时随着时间的推移每个样品颜色都会变深,这可能是由