实验五 血液中谷丙转氨酶活力的测定-2

实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定【目的和要求】了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下。正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。【操作方法】1．标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。试剂(ml)试管号012345丙酮酸钠标准液-0.050.100.150.200.25谷丙转氨酶底物0.500.450.400.350.300.25磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH7.4）0.100.100.100.100.100.102,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。先将试管置于37℃2．酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5ml,置于37℃水浴内10min，使管内外温度平衡。取血清0.1ml加到第1号试管内，继续保温60min。到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5ml，于37℃保温20min,然后再向2支管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值（显色后30min至2小时内其色度稳定）。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。（用1【试剂和器材】一`试剂1．试管及试管架2．吸管3．恒温水浴4．分光光度计二`器材1．0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）2．2.0μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内[当日配制]。3．谷丙转氨酶底物。取分析纯α-酮戊二酸29.2mgDL-丙氨酸1.78g克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4后，加磷酸缓冲液至100ml。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0μmol，丙氨酸200μmol。[在冰箱内可保存一周]。4．2，4-二硝基苯肼溶液。在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼19.8mg，加100ml1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并