半抗原免疫分析课件

半抗原免疫分析ABC2020/11/31半抗原免疫分析ABC2020/11/31内容一、基本概念抗原抗体二、免疫分析方法分类ELISA原理与方法方法建立-苏丹红为例2020/11/32内容一、基本概念2020/11/32

抗原

antigen,Ag2020/11/33抗原2020/11/33(一)抗原的概念

抗原(Antigen,Ag)是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答,并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质.2020/11/34(一)抗原的概念2020/11/34(二)完全抗原与半抗原1.完全抗原（complexantigen):

既具免疫原性又有免疫反应性的物质.

如:大多数蛋白质.2.半抗原(hapten):

仅有免疫反应性而无免疫原性的物质.如:大多数多糖、类脂、某些药物.

半抗原+载体(蛋白质)完全抗原2020/11/35(二)完全抗原与半抗原2020/11/352020/11/362020/11/36共同抗原与交叉反应2020/11/37共同抗原与交叉反应2020/11/37共同抗原与交叉反应

1.共同抗原(Commonantigens)：存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗原决定簇，称为共同抗原。

2.交叉反应(Cross-reaction)：由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。检测意义：假阳性（避免）多残留检测（利用）2020/11/38共同抗原与交叉反应2020/11/382020/11/392020/11/39农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防腐剂、植物激素等半抗原

在食品安全、植物学、环境检测等领域，主要是半抗原类物质。2020/11/310农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防腐剂、植物激素等半抗抗体

antibody,Ab抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁；两者既是好朋友，又是一对冤家。2020/11/311抗体

antibody,Ab抗原与抗体是天生一、基本概念1.抗体（Antibody，Ab）指B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

存在形式：

膜型（membraneimmunoglobulin,mIg）

—

B细胞膜上的抗原受体；

分泌型(secretedimmunoglobulin,sIg)

—

分泌进入体液,

介导体液免疫应答。2020/11/312一、基本概念1.抗体（Antibody，Ab）2020/二、免疫球蛋白的分子结构（一）免疫球蛋白的基本结构：由四条多肽链组成，呈“Y”或“T”型

1.组成：

2条长链，又称重链（Heavychain，H链）：含450-550aa，分子量为55-75KD。

2条短链，又称轻链（Lightchain，L链）：含214aa，分子量为25KD。2020/11/313二、免疫球蛋白的分子结构（一）免疫球蛋白的基本结构：20202020/11/3142020/11/3142020/11/3152020/11/3152.分类、分型：（1）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将Ig分为五类：

IgM(µ)、IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgE(ε)

亚类：IgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4IgA：IgA1,IgA2IgM:IgM1,IgM2（2）分两型：

根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻链分为两型：κ和λ型每一Ig单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须同型。2020/11/3162.分类、分型：2020/11/3162020/11/3172020/11/317抗体的制备方法2020/11/318抗体的制备方法2020/11/3182020/11/3192020/11/3193.基因工程抗体(GeAb):

第三代抗体

由基因重组技术制备的抗体,称为基因工程抗体。

嵌合抗体(chimericAb)

人源抗体（humanizedAb)

双特异性抗体（bispecificAb)

Fab/ScFV（singlechainFVfragment)

单域抗体（singlechainAb)

2020/11/3203.基因工程抗体(GeAb):2020/11/320抗体的结构与功能的关系，所展现出的生物学功能是其结构的完美表演者。2020/11/321抗体的结构与功能的关系，2020/11/321免疫分析技术内容分析方法分类几种常用免疫分析技术ELISA侧流免疫层析分析方法的建立分析数据的拟合2020/11/322免疫分析技术内容2020/11/322常用的免疫标记物质类别标记物用途荧光素

FITC、RB200、TRITC免疫组化镧系元素螯合物免疫分析测定放射性核素

3H、14C、32P、57Gr免疫分析测定

125I、131I酶

HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol、lucigenin免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定

2020/11/323常用的免疫标记物质类别一、标记免疫方法分类1．按标记物的种类分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)(2)酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)(3)化学发光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CIZIA)(4)荧光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay，FIA)。。。。。2020/11/324一、标记免疫方法分类1．按标记物的种类分(1)放射免疫分析2

2．按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(homogeneouslmmunoassay)

在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzymemultipliedimmunoassaytechnique，EMIT)。(2)非均相免疫分析(heterogeneousimmunoassay)

在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后，才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如ELISA(Enzymelinkedimmunosorbentimmunoassay)2020/11/3252．按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(homogeneELISA简介2020/11/326ELISA简介2020/11/326（一）ELISA技术的原理间接法

夹心法

竞争法2020/11/327（一）ELISA技术的原理间接法2020/11/3272020/11/3282020/11/328夹心法Sandwich2020/11/329夹心法2020/11/329竞争法2020/11/330竞争法2020/11/330（二）ELISA所用试剂材料1、固相2、酶3、底物4、缓冲液5、仪器2020/11/331（二）ELISA所用试剂材料1、固相2020/11/3311、固定相聚次亚乙烯2020/11/3321、固定相聚次亚乙烯2020/11/3322、最常用的标记酶1．辣根过氧化物酶(HRP):约有50％的EIA使用此酶。2．碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定，其活性可用分光光度计或荧光计测量。3．6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD):通常用于均相EIA。4．β-半乳糖苷酶(β-Gal):适用于均相EIA和非均相EIA。5．苹果酸脱氢酶(MDH):多用于尿样的均相EIA。2020/11/3332、最常用的标记酶1．辣根过氧化物酶(HRP):约有50％的3、最常用的底物邻苯二酚(OPC)四甲基联苯胺(TMB)2020/11/3343、最常用的底物邻苯二酚(OPC)2020/11/3344、缓冲液PBS(T)Tris-HClNa3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂2020/11/3354、缓冲液PBS(T)2020/11/335酶标仪4、仪器2020/11/336酶标仪4、仪器2020/11/336酶标仪2020/11/337酶标仪2020/11/337（三）免疫分析方法建立

——苏丹红为例2020/11/338（三）免疫分析方法建立

——苏丹红为例2020/11/33Step1:Haptenandconjugate2020/11/339Step1:Haptenandconjugate20Step2:characterizationofconjugate2020/11/340Step2:characterizationofcoStep3:chessboardtiatrionandcalibrationcurve2020/11/341Step3:chessboardtiatrionanStep4:optimization—nonessential

2020/11/342Step4:optimization—nonessent例1、标记抗原浓度对检测的影响2020/11/343例1、标记抗原浓度对检测的影响2020/11/343例，pH影响2020/11/344例，pH影响2020/11/344Step5:sampleanalysis2020/11/345Step5:sampleanalysis2020/11Step6:validation2020/11/346Step6:validation2020/11/346一个难点：基质效应2020/11/347一个难点：基质效应2020/11/347基质效应基质：样品中除了目