度人教版血红蛋白的提取和分离

2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究

新华网首尔１２月２９日电（记者干玉兰）韩国浦项工业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期《分子细胞》杂志上。

2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩＭ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。我国对蛋白质的现阶段研究

我国独立主持国际“人类肝脏蛋白质组计划”，参加国际人类蛋白质组研究计划中的“大规模抗体制备”项目

专题5DNA和蛋白质技术课题3：血红蛋白的提取和分离思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？一.基础知识蛋白质分离和提取的原理：

根据蛋白质各种特性（理化性质）的差异,

来分离不同种类的蛋白质。(如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等)（一）凝胶色谱法1、概念：

也称分配色谱法，根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。2、凝胶的基本知识：凝胶形态：组成：

结构：微小多孔的球体大多是由多糖类化合物形成如葡聚糖、琼脂糖内含许多贯穿的通道

①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道；3、凝胶色谱法的原理③分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。②当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；4、分离过程混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1、使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中

（

）练习巩固

（二）缓冲溶液

1.概念:

在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。

能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制:

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:

利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察和研究。磷酸缓冲液（三）电泳1、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理：◆电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。◆许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。◆在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。++++++++++++++++++++电泳原理图解原理(p66):SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

为什么提取血红蛋白用哺乳动物的红细胞？哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，并且血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

？

动动脑二、实验操作－－实验步骤样品处理粗分离纯化纯度鉴定

血液组成成分

1.洗涤

红细胞

2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白课题3血红蛋白的提取和分离血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链

亚铁血红素课题3血红蛋白的提取和分离（Ⅱ）

1.洗涤

红细胞洗涤过程：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂红细胞破碎液高速离心10min离心管滤纸过滤烧杯3分离血红蛋白4透析纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱课题3血红蛋白的提取和分离材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:2.凝胶色谱柱的装填：步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱3.样品的加入和洗脱课题3血红蛋白的提取和分离（Ⅱ）注意事项1.红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区