罗氏沼虾淀粉酶基因克隆及其表达分析

罗氏沼虾淀粉酶基因克隆及其表达分析

0东南亚umrandiii研究意义上：罗氏沼气虾产于东南亚国家。由于其生长速度快、口感好、肉长得、不必要的特点，已成为中国重要的淡水养殖品种之一。1材料和方法1.1资料采集和分析5月龄罗氏沼虾由广西南宁国家级罗氏沼虾良种场提供。以肝胰腺为素材，进行AMY基因克隆；分别选取7尾雌/雄罗氏沼虾采集样品，包括腹神经节、胃、心脏、鳃组织、性腺、肝胰腺、肌肉和肠道共8个组织，用于AMY基因表达分析；同时采集生长快速家系（FG）和生长慢速家系（SG）中体重和体长极端性状的雌性罗氏沼虾肌肉组织（1.2rna浓度和完整性检测采用TRIzol提取罗氏沼虾样品总RNA，利用NanoDrop2000和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及其完整性，再以PrimeScript1.3知识产权pcr扩增根据GenBank已公布的罗氏沼虾AMY基因EST序列（KM886337.1），利用AMY-1引物扩增AMY基因CDS序列，PCR反应体系15.0μL:2×TaqMasterMix7.5μL，上、下游引物各0.5μL,cDNA模板1.0μL,RNase-freeddH1.4亲/疏水性及结构预测利用ExPASyProtParam(/protparam/）分析罗氏沼虾AMY基因编码蛋白理化性质；采用ExPASyProtScale(/protscale/）进行亲/疏水性预测；运用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测其信号肽；使用SMART(http://smart.embl.de/）进行结构域预测；利用MLRC(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa＿mlrc.html）和SWISS-MODEL(/）分别进行编码蛋白的二、三级结构预测；并以DNASTAR中的MegAlign和Lasergenev8.0分别进行同源比对及系统发育进化树分析。1.5所见的人类基因的发现分析基于克隆获得的AMY基因CDS序列，以18SrRNA序列（DQ642856.1）为内参基因（2结果与分析2.1李氏沼虾amy基因cds序列及测序结果PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得1条明亮清晰、大小约2000bp的特异性条带（图1），与预期结果相符。测序结果显示，罗氏沼虾AMY基因CDS序列全长2121bp，共编码706个氨基酸残基；氨基酸序列比对分析发现其与NCBI已发布罗氏沼虾（GenBank登录号KM886337.1）相应氨基酸序列的相似性达99.9%，仅是第251位碱基由A→G，导致第84位酪氨酸（Tyr）突变为半胱氨酸（Cys）（图2）。2.2罗氏沼虾amy蛋白亲水性及结构域分析结果罗氏沼虾AMY基因编码蛋白分子量为76.87kD，理论等电点（pI）为4.63。罗氏沼虾AMY蛋白的甘氨酸（Gly）含量较高，占总氨基酸数的12.60%；带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）为83个，带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）为42个，不稳定系数为33.17（属于不稳定蛋白），脂肪数为59.80;AMY蛋白亲水性平均值为-0.398，具有较强的亲水性（图3），与ExPASyProtParam预测得到的亲水性平均系数（GRAVY=-0.398）一致，故推测罗氏沼虾AMY蛋白为不稳定的亲水性蛋白。SMART的结构域预测结果表明，罗氏沼虾AMY蛋白存在信号肽，且信号肽是由AWA-YD组成，其剪切位点分别在第18位和第19位氨基酸残基间。罗氏沼虾AMY蛋白还包含2个典型的淀粉酶结构域，即domainA(2.3生磷酸化位点及氨基酸位点分析罗氏沼虾AMY蛋白不存在糖基化位点；其磷酸化位点预测结果（图4）显示，在AMY肽链中可能发生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位点有80个，其中，苏氨酸（Thr）磷酸化位点29个，丝氨酸（Ser）磷酸化位点37个，酪氨酸（Tyr）磷酸化位点14个。由于AMY肽链是以丝氨酸磷酸化位点为主，故推测罗氏沼虾AMY蛋白是以丝氨酸为主、苏氨酸为辅的磷酸化修饰调控其生物功能。2.4卷/链-延伸链占比罗氏沼虾AMY蛋白二级结构预测结果（图5）显示，以无规则卷曲占比最高（占64.73%），其次是延伸链（占21.39%），α-螺旋仅占13.88%。利用SWISS-MODEL预测罗氏沼虾AMY蛋白可能存在的三级结构，结果如图6所示。2.5资料同源性比对分析根据NCBI已公布的AMY基因EST序列，可知罗氏沼虾AMY基因CDS序列编码706个氨基酸残基。针对罗氏沼虾（AKL71614.1）、斑节对虾（AME17649.1）、凡纳滨对虾（AIJ02079.1）、太平洋牡蛎（CAA69658.1）、褐虾（AWU67110）、合浦珠母贝（AGN55419.1）、克氏原螯虾（AXC43909.1）、大珠母贝（AEI58897.1）及中华绒螯蟹（ANG56301.1）的AMY氨基酸序列进行同源比对分析，结果（图7）显示，罗氏沼虾与克氏原螯虾的相似性最高（62.6%），与大珠母贝的相似性较低（48.9%）。基于AMY氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树（图8）显示，罗氏沼虾与克氏原螯虾的亲缘关系最近，而与中华绒螯蟹的亲缘关系较远。2.6相对表达量如图9所示，AMY基因在雄性罗氏沼虾不同组织中的相对表达量以肝胰腺最高，其次是胃，鳃组织的相对表达量最低；在雌性罗氏沼虾中以肝胰腺的相对表达量最高，其次是胃，而肌肉的相对表达量最低。对比相同组织不同性别个体的AMY基因相对表达量发现，罗氏沼虾AMY基因在雌性个体肠道中的相对表达量极显著高于雄性个体（P<0.01，下同），鳃组织中的相对表达量显著高于雄性个体（P<0.05），肝胰腺中的相对表达量极显著低于雄性个体，而腹神经节、胃、心脏、性腺和肌肉中的相对表达量差异不显著（P>0.05）。可见，AMY基因在罗氏沼虾不同组织中广泛表达，但存在性别差异性和组织特异性。2.7等生长性状表型值差异为探究罗氏沼虾AMY基因在不同生长速度家系个体中的表达规律，以体重和体长等生长性状表型值差异极显著的FG和SG个体为供试材料，实时荧光定量PCR检测不同生长速度家系个体肌肉中的AMY基因表达情况。由图10可知，罗氏沼虾AMY基因在FG个体肌肉中的相对表达量极显著高于SG个体的相对表达量。3肠道组织中肝胰腺组织中的相对表达AMY是甲壳类动物体内主要的消化酶类，对其新陈代谢及生长发育等活动发挥着极其重要的作用（本研究对罗氏沼虾AMY基因的组织表达差异进行分析，发现AMY基因在罗氏沼虾不同组织中广泛表达，但存在性别差异性和组织特异性，具体表现为：雌性个体肠道中的相对表达量极显著高于雄性个体，鳃组织中的相对表达量显著高于雄性个体，而肝胰腺中的相对表达量极显著低于雄性个体。AMY基因在雄性罗氏沼虾不同组织中的相对表达量排序为肝胰腺>胃>腹部神经>肠道>精巢>心脏>肌肉>鳃组织，在雌性罗氏沼虾中则表现为肝胰腺>胃>肠道>卵巢>腹神经节>心脏>鳃组织