真武汤对转基因扩张型心肌病小鼠心脏功能及心肌纤维化的影响

真武汤对转基因扩张型心肌病小鼠心脏功能及心肌纤维化的影响

扩张性心肌病是一种危害健康的疾病，其死亡率很高。它的主要病理特征是心肌的间质纤维。心肌细胞有巨大的压力，大细胞和收缩的心肌细胞共存。心肌细胞的形态参数有变化，如规模和浓染，变形细胞与肿瘤细胞相似。固体颗粒稀释。心肌细胞的布局混乱。1材料表面1.1实验动物的选择本实验采用的α-myosinheavychain(MHC)-cTnTR141W转基因扩张型心肌病小鼠和正常C57BL/6J小鼠购买与中国医学科学院实验动物研究所(实验动物合格证编号:11401800000375)。1.2sabc试剂盒真武汤(药用:茯苓45g，白术30g附子15g，芍药45g，生姜45g)药材购自辽宁中医药大学附属医院药房;卡托普利(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H31022986);MaximaSYBRGreen/ROXqPCR(ThermoFisher，货号K0223);RevertAidTMFirststrandcDNA(ThermoFisher，货号K1622);兔抗小鼠Col1a1、Col3a1一抗;即用型SABC试剂盒;羊抗兔IgG-HRP均购自wanleibio公司。1.3双垂直蛋白电泳仪和elx-400酶标仪Exicycler96荧光定量PCR仪(BIONEER),WD-9405B水平摇床(北京六一)，DYY-7C电泳仪(北京六一)，DYCZ-24DN双垂直蛋白电泳仪(北京六一)，ELX-800酶标仪(BIOTEK)。2方法2.1自由结构小鼠成年DCM雄鼠与野生型雌鼠按1:1合笼，饲养温度为恒温25℃，各组小鼠自由进食水。C57BL/6J小鼠15只作为空白对照组组，cTnTR141W转基因扩张型心肌病小鼠60只，按照体重随机分为模型对照组、西药组、中药高剂量组及中药中剂量组，每组15只。2.2小鼠服用剂量计算给药方法:予真武汤灌胃，真武汤由本院制剂室以水煎、浓缩制成(草药在2000mL蒸馏水中浸泡30min，后煮沸30min直至药液浓缩至150mL，并过滤，保存在-20℃的冰箱中备用)。按人和小鼠之间等效剂量换算方法，计算出小鼠服用剂量18.2g/(kg·d)(中剂量);高剂量组用药为36.4g/(kg·d);西药组予卡托普利10mg/(kg·d)灌胃，每日2次灌胃，每次0.3mL，空白对照组及模型空白组给予同等剂量生理盐水灌胃，连续给药4周。2.3提交材料最后一次灌胃后，禁食24h,10%水合醛麻醉，开腹，腹主动脉取血，取出心脏组织，于高温灭菌EP管中-80℃冻存。2.4指标检测2.4.1超声影像分析本实验小动物超声影像系统Vevo2100型由辽宁中医药大学重大高校科技平台实验室提供。用异氟烷吸入麻醉，应用MS250超声探头，探头频率30MHz，增益为10dB的条件下，进行心脏超声影像分析。测量数据包括:左室收缩末期内径(LVEDs);，左室舒张末期内径(LVEDd);射血分数(EF);短轴缩短率(FS%)。2.4.2温度对封板的影响具体步骤主要包括:(1)标准品稀释和加样;(2)加样;(3)温育:将封模板封板后放置在37℃恒温培养箱中温育30min;(4)洗涤;(5)加酶;(6)显色;(7)终止;(8)测定。实验重复3次，结果以x珋±s表示并进行数据统计学分析。2.4.3ma约瑟夫染色观察了各组心肌细胞和中间物质的变化取5月龄小鼠心脏组织，固定于4%多聚甲醛，24h后修块、脱水、包埋、切片。进行常规Masson染色，在光镜下观察。2.4.4总rna提取及rna浓度计算运用Primer-BLAST设计引物。取小鼠心肌组织，按Trizol说明书操作步骤提取总RNA，使用核酸蛋白分析仪检测吸光度，并记录OD260及OD260/280比值，计算RNA浓度。之后用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,qRT-PCR法逆转录PCR，反应结束后记录各组的Ct值，利用qRT-PCR分析基因在不同组织中的表达差异。2.4.5监测总抗体、中药抗体的增殖实验流程包括:蛋白质抽提、蛋白质定量、SDS、转印、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ECL底物发光、抗体剥脱、封闭、孵育内参抗体、孵育二抗、ECL底物发光、图像保存。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。3结果3.1超声检测小鼠心脏功能和心脏结构见表1。3.2各组小鼠心功能情况比较见表2、插页Ⅴ图1。各组小鼠BNP水平比较:与正常组比较，模型组BNP水平显著升高(P<0.01)，有统计学意义，模型组小鼠心功能降低，说明转基因扩张型心肌病小鼠存在心功能减低，卡托普利组、真武汤中高剂量组BNP水平均有所升高，但无统计学意义;与模型组比较，卡托普利组、真武汤中高剂量组BNP水平均显著降低(P<0.01);与阳性药物(卡托普利)组比较，真武汤中高剂量组BNP水平差异无统计学意义，说明真武汤在一定程度上能改善扩张型心肌病小鼠的心脏功能，与卡托普利组比较具有非劣性。3.3各组小鼠心肌组织排列见图2。Masson染色可见正常组小鼠心肌排列整齐，胶原纤维含量较少;模型组转基因小鼠心肌排列比较紊乱，心肌间质胶原纤维明显增多;卡托普利组与真武汤高中组心肌细胞排列较整齐，胶原较少，间质的纤维化减轻。3.4col11a和col31amsra的显示3.4.1各组心肌组织col1a1mrna表达比较见表3。与正常组比较，模型组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达显著升高(P<0.01)，卡托普利组、真武汤高中剂量组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达均有不同程度的升高(P<0.01);与模型组比较，卡托普利组、真武汤高中剂量组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达均有不同程度的降低(P<0.01);与卡托普利组比较，真武汤高剂量组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达较高，但无明显统计学差异，真武汤中剂量组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达较高，有统计学差异(P<0.01);与真武汤高剂量组相比较，中剂量组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达有所升高(P<0.05)。3.4.2各变量在达均有不同程度的上升见表4。与正常组比较，模型组小鼠心肌组织Col3a1mRNA表达显著升高(P<0.01)，卡托普利组、真武汤高中剂量组小鼠心肌组织Col3a1mRNA表达均有不同程度的升高(P<0.01);与模型组比较，卡托普利组、真武汤高中剂量组小鼠心肌组织Col3a1mRNA表达均有不同程度的降低(P<0.01)，其中真武汤高剂量组降低最显著;与卡托普利组比较，真武汤高剂量组小鼠心肌组织Col3a1mRNA表达较低，但无明显统计学差异，真武汤中剂量组小鼠心肌组织Col3a1mRNA表达较高，有统计学差异(P<0.01);与真武汤高剂量组相比较，中剂量组小鼠心肌组织Col1a1mRNA表达有所升高(P<0.01)。3.5col11a和col31a的水平3.5.1各组心肌组织col1a1蛋白表达水平比较见图2。与正常组比较，模型组小鼠心肌组织Col1a1蛋白表达明显升高(P<0.01)，卡托普利组小鼠心肌组织Col1a1蛋白表达有所减低，但无明显统计学差异，真武汤高剂量组小鼠心肌组织Col1a1蛋白表达与正常组的表达相当，无明显统计学差异，真武汤中剂量组小鼠心肌组织Col1a1蛋白表达高于正常组(P<0.01);与模型组比较，卡托普利组、真武汤高中剂量组心肌组织Col1a1蛋白表达均有所下降(P<0.01)，但以卡托普利组下降最为明显，真武汤高剂量组次之，真武汤中剂量组下降最少。3.5.2各组心肌组织col3a1蛋白表达水平比较见图3。与正常组比较，模型组、卡托普利组小鼠心肌组织Col3a1蛋白表达明显升高(P<0.01)，但以模型组升高最为显著，真武汤高中剂量组未见显著差异(P>0.05);与模型组比较，卡托普利组、真武汤高中剂量组小鼠心肌组织Col3a1蛋白表达显著降低(P<0.01);各用药组组间比较，卡托普利组下调Col3a1蛋白表达作用最佳(P<0.01)，真武汤高中剂量组组间未见明显差异(P>0.05)。4各组心肌纤维化表达扩张型心肌病是一种遗传性心脏病，2004年的一项研究发现在我国DCM的患病率约0.02%DCM的病因与病毒感染、自身免疫、妊娠、基因遗传等因素有关心肌细胞外基质的胶原成分有I、III、IV、V、VI等型，其中Col1a1及Col3a1型胶原纤维是细胞外基质的主要成分，主要由心肌间质细胞生成，占总间质胶原的75%左右目前中药治疗心肌纤维化显示具有良好的效果。吴岚等本研究Westernblot和RT-PCR结果显示与模型组相比，真武汤