固相萃取法分离鉴定菊科植物款冬

固相萃取法分离鉴定菊科植物款冬

款冬花是蔷薇科植物的款冬发芽。具有润肺、益气、止咳、粘液等功效。主要产于中国东北、华北、华东、西北、湖南、江西、贵州、云南、西藏等地。1仪器、试剂和试药WatersH-CLASSUPLC色谱仪(Waters公司);二极管阵列检测器(Waters公司);ASE350型旋转蒸发仪(Heidolph公司);KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)XS105DU十万分之一电子分析天平(上海托利多有限公司);Mili-Q超纯水系统(Millipore公司)。CleanetPCX固相萃取小柱(500mg/6mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司)。对照品克氏千里光碱(批号:ZZS19072502)由上海甄准生物科技有限公司提供;对照品的纯度大于98%;乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵均为质谱级(Fisher)，其他试剂为分析纯。款冬花分别采自河北省和甘肃省，经中国食品药品检定研究院中药民族药检定所研究员鉴定为菊科植物款冬TussilagofarfaraL．的干燥花蕾。2方法和结果2.1条件1色谱柱:WatersCORTECSUPLCC2.2溶液的制备2.2.1对照溶液的制备取克氏千里光碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即为对照品溶液。2.2.2固相萃取萃取液的制备取款冬花粉末(过四号筛)2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇40mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，过滤，残渣用5mL甲醇洗涤2次，过滤，合并滤液，50℃减压回收溶剂至约1mL，后加入0.5%的硫酸水溶液10mL溶解或混悬，进行固相萃取;固相萃取具体流程为:先用5mL甲醇活化阳离子固相萃取柱(CleanetPCX,500mg/6mL)后，用0.5%硫酸水溶液平衡固相萃取柱，然后将上述硫酸水的样品溶液加至固相萃取柱上，甲醇20mL淋洗除杂，浓度为8%氨水-甲醇=1∶3溶液10mL洗脱，收集洗脱液，50℃减压回收溶剂至约2mL，加入甲酸1mL，用水定容至5mL,0.22μm有机滤膜过滤，即为供试品溶液。2.3方法研究2.3.1检测限和定量限精密吸取对照品储备溶液，加甲醇配制成2.048、5.12、10.24、20.48、40.96、81.82μg·mL以定量离子对的色谱峰信噪比S/N=3对应的最低浓度为检测限(LOD)，以定量离子对色谱峰信噪比S/N=10对应的最低浓度为定量限(LOQ)，检测限为0.05μg·mL2.3.2精密度测试精密吸取克氏千里光碱对照品溶液1μL，连续进样6次，测定其峰面积，RSD分别为0.63%(n=6)，见表1，结果表明仪器精密度良好。2.3.3溶液稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(编号1)，分别于配制后0、2、4、8、12和24h，按前述色谱条件测定峰面积，克氏千里光碱峰面积平均值为769844,RSD为0.76%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。2.3.4重复性试验结果取本品粉末(编号1),2.00g，共6份，按前述方法测定，结果克氏千里光碱平均含量为0.00534%,RSD为2.44%，表明本试验重复性良好。2.3.5加样回收率和rsd率取已知含量的同一批样品(编号1),6份，每份1.0g，分别置具塞锥形瓶中，再分别依次精密加入浓度为40.96μg·mL上述结果表明，6份克氏千里光碱的平均回收率为89.46%,RSD值为2.80%，该方法准确率高。2.4克氏千里光碱含量测定分别准确称取不同产地的款冬花药材2.0g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，依据外标法计算克氏千里光碱的含量，结果见表2。3讨论3.1款冬花中克氏千里光碱的检测克氏千里光碱具有共轭双键结构，采用二极管阵列检测器扫描220nm左右具有最大吸收峰(图3)，通过固相萃取技术富集样品中的克氏千里光碱并除去大部分干扰成分，同时借助UPLC较高的灵敏度，可实现UPLC-DAD法对款冬花中克氏千里光碱的准确测定。3.2里西啶氧化物的分离能力本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸、甲酸铵等含酸溶液作为流动相对吡咯里西啶生物碱的分离能力的影响。通过调节流动相比例，通过预实验最终确定流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)恒流洗脱，在该系统下5min内能够完成对克氏千里光碱的分离，并且峰形对称，理论塔板数高，能够达到定量测定的要求。3.3克氏千里光碱含