广西5个克氏原螯虾群体遗传多样性分析

广西5个克氏原螯虾群体遗传多样性分析

0cl麻黄虾【研究意义】元白虾，也被称为幼龙虾，在北美原产。它尝起来又新鲜又漂亮，营养丰富，价格低，深受消费者喜爱。它很快传播到夏威夷、日本、欧洲和尼罗河流域。1材料和方法1.1小龙虾养殖选择收集广西5个地区的克氏原螯虾群体样本，每个地区20～30尾，分别取自南宁（NN）、大塘（DT）、融水（RS）、柳州（LZ）和来宾（LB）的小龙虾养殖场，其虾苗均未经过人工选育。不同地区的克氏原螯虾虾苗来源、采集时间和数量信息详见表1。1.2对卫星诱导物的过滤和合成从1.3asek-cb3的制备根据天根生化科技（北京）有限公司的DNA抽提试剂盒（#DP304）说明抽提克氏原螯虾基因组DNA，具体步骤：取20mg背部肌肉剪碎，加入200μL缓冲液GA和20μLProteinaseK溶液，混匀，56℃水浴锅消化3h；加入200μL缓冲液GB，充分混匀，70℃作用10min后加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s；将所得溶液加入吸附柱CB3中，12000r/min离心1min，弃废液；将吸附柱CB3放回收集管中，加入500μL缓冲液GD,12000r/min离心1min，弃废液；将吸附柱CB3放回收集管中，再加入600μL漂洗液PW,12000r/min离心1min，弃废液；将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min空离2min，室温静置5min，向吸附柱CB3中央滴加80μL灭菌ddH1.4聚合酶聚合酶系统采用8对微卫星引物对待检测的克氏原螯虾样品进行PCR扩增，反应体系20.0μL:10×TaqPCRMasterMix聚合酶[天根生化科技（北京）有限公司]10.0μL，正、反向引物（10μmol/L）各0.5μL,DNA模板3.0μL(400ng),ddH1.5微观聚类分析经电泳获得各样品微卫星位点信息后，采用PopGene32和NTSYSpc2.1等在线软件分析不同地区克氏原螯虾群体微卫星位点的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannonʼs信息指数（I）、Ho、He、基因流（Nm）、遗传分化指数（Fst）、遗传相似性系数及遗传距离等参数，使用PHYLIPv3.5进行聚类分析。Hardy-Weinberg平衡偏离指数（D）是反映群体在某个微卫星位点偏离Hardy-Weinberg平衡程度的参数，计算公式为D=(Ho-He）/He；多态信息含量（PIC）反映微卫星DNA的变异程度，是衡量微卫星位点多样性的重要指标（2结果与分析2.1pcr扩增电泳结果采用8对微卫星引物对广西不同地区克氏原螯虾群体共140份样品进行PCR扩增，经电泳凝胶成像均获得清晰的电泳条带，部分微卫星位点的PCR扩增电泳结果如图1所示。2.2克氏原螯虾的平均na选取8个微卫星位点对广西不同地区克氏原螯虾群体的等位基因及有效等位基因进行分析，结果发现5个克氏原螯虾群体的8个微卫星位点共检测到37个等位基因，平均Na为3.925个，每个微卫星位点的Na在3～6个，其中，PclG02的Na最少（3个），PclG07的Na最多（6个），各地区克氏原螯虾群体的平均Na为3.750～4.250（表3），不存在明显差异。8个微卫星位点的平均Ne为1.5267～4.6997；各地区克氏原螯虾群体的平均Ne为2.5142～3.0574，其中柳州群体和融水群体的Ne较高（2.9328和3.0574），而南宁群体的Ne较低（2.5142）。2.3广西克氏原螯虾群体的pic、多态性特征通过PopGene32对广西不同地区克氏原螯虾群体8个微卫星位点进行群体内遗传多样性分析，结果显示，南宁克氏原螯虾群体的平均I为0.9843，大塘、融水、柳州和来宾4个克氏原螯虾群体的平均I则在1.1000以上（表3）。从表4可看出，5个克氏原螯虾群体在8个微卫星位点中均存在不同程度的多态性。其中，5个群体的平均Ho在0.3563～0.5208，以南宁群体和柳州群体最高、来宾群体最低；但南宁群体的平均He最低（0.5708），而其他4个群体均在0.6200以上。南宁克氏原螯虾群体的平均PIC为0.4899，呈中度多态性（0.25<PIC<0.50）；而其他4个克氏原螯虾群体的平均PIC在0.5496～0.5843，均呈高度多态性（PIC>0.50）。5个克氏原螯虾群体的平均D均为负值，表明广西克氏原螯虾群体总体上处于杂合子缺失状态。南宁群体中有4个微卫星位点的杂合子缺失，平均D最接近于0，相对于其他群体而言较平衡；其他4个群体的8个微卫星位点中有6～7个处于杂合子缺失状态，以来宾群体最明显，D为-0.4418，杂合子缺失及偏离Hardy-Weinberg平衡最严重（表4）。经卡方检验，发现南宁群体有4个微卫星位点处于极显著水平（P<0.01，下同）及1个微卫星位点处于显著水平（P<0.05，下同），其他4个群体则存在6～8个微卫星位点处于显著或极显著水平（表5），表明广西不同地区克氏原鳌虾已发生不同程度的Hardy-Weinberg平衡偏离。2.4群体间的nm和fst采用PopGene32对广西不同地区克氏原螯虾群体进行种群间的遗传分化分析，结果显示，5个群体间的Nm在2.3898～6.0284（表6），说明不同群体间存在一定程度的交流；其中，柳州群体与来宾群体的Nm最高（6.0284），其次是融水群体与柳州群体的Nm(5.2530）及南宁群体与柳州群体的Nm(4.2289），说明这些地区属于随机交配的群体；而其他群体间的Nm在2.0000～4.0000，属于高度交流的群体。群体间的Nm越大，则Fst越小。5个克氏原螯虾群体间的Fst在0.0398～0.0947，其中，柳州群体与来宾群体的Fst最小，其次是柳州群体与融水群体（0.0454），而其他群体间处于中度分化水平，其所有群体间尚未出现高度分化现象。由表7可知，广西不同地区克氏原螯虾群体间的遗传相似系数在0.6861～0.8583，均具有较高的亲缘关系，对应的遗传距离为0.1528～0.3768。其中，柳州群体与来宾群体的遗传相似系数最高，遗传距离最近，表明这两个群体间的亲缘关系最近，遗传变异程度较小；大塘群体与来宾群体的遗传相似系数最低，遗传距离最远，表明这两个群体间在5个群体中的亲缘关系较远，变异程度相对较大。2.5聚类分析结果基于遗传距离通过PHYLIPv3.5对广西不同地区克氏原螯虾群体进行UPGMA聚类分析，结果显示5个克氏原螯虾群体可分为两大分支（图2），其中，南宁群体和大塘群体聚类为一支，而柳州群体先与来宾群体聚类再与融水群体聚类成另一支。由各克氏原螯虾群体间的遗传距离长度（在各自线条上方）也可知，柳州群体与来宾群体的遗传距离最近。3基于文化多样性的群落多样性明确克氏原螯虾的生物多样性，可提高其育种筛选效率，进而增强克氏原螯虾的适应能力。广西克氏原螯虾的生物多样性至今尚未得到系统研究，仅有Fst是衡量群体间遗传分化的重要参数，Fst在0.0