伤寒杆菌O抗与H抗血清的制备及其应用

伤寒杆菌O抗与H抗血清的制备及其应用关键词】伤寒杆菌在微生物实验课教学中,肥大反应(WidalStest)被列为本科临床专业学生实验的必修内容之一。近年来,由于抗生素的早期应用,临床随机采集的患者血清标本抗体含量很低,实验中很难出现典型的抗原抗体凝集现象,由于实验要用到抗血清,而抗血清又难以买到,价格也昂贵,为了节约经费，使用方便，我们尝试了自制抗血清，并且在实验教学中，通过制备抗血清进行抗原抗体之间免疫学反应，使学生获得有关抗原、抗体、抗原抗体间的免疫反应这些抽象的免疫学的基本知识，使教学获得了较好的效果。材料与方法动物的选择实验动物为家兔，体重kg/只~kg/只。抗原的制备伤寒杆菌的抗原制备采用北京生物制品鉴定所提供的国内标准菌株伤寒杆菌“O”接种在普通琼脂平板上约20只〜30只，置37℃培养18h〜24h，取培养物作涂片，并行革兰染色，经显微镜观察应均为革兰阴性杆菌的纯培养物，并作生化鉴定，葡萄糖(+)、乳糖(-)、靛基质(-)、尿素(-)、动力(+)，并用伤寒诊断血清“O”作玻片凝集，出现颗粒凝集确诊为伤寒杆菌“O”抗原,1如有污染杂菌的平板应弃去，而纯培养的平板加5ml〜6ml无菌生理盐水，用L型玻棒刮下菌苔，离心沉淀（2500转/min,10min）,同法用无菌生理盐水洗涤两次，弃上清，取沉淀物加适量灭菌生理盐水配成30亿/ml的菌液［1］,并按菌量加入%〜％甲醛作防腐，置37℃作用30min进行杀菌处理，即为伤寒杆菌“O”菌液，置4℃冰箱备用。伤寒杆菌“H”菌液的制备［1］，方法同伤寒杆菌“O”抗原制备,此菌株也来自北京生物制品鉴定所。免疫动物的方法［2］实验动物为家兔,共12只,分别注射伤寒杆菌“O”、“H”菌液各6只，程序见表1。表1：免疫注射程序日期（略）结果与保存抗血清效价测定与保存于末次免疫1周后在耳缘静脉采血2ml分离血清，抗血清效价测定采用试管凝集法（肥大反应），用生理盐水作血清稀释液，倍比依次稀释血清，置37℃24h后观察结果,以呈现++凝集的血清最高稀释倍数作为血清凝集的效价。达到理想的抗体效价后采用心脏采血收集血清分装成小瓶,每瓶约3ml~5ml，做好标记，置-20℃冰箱保存。 试管凝集实验将10个洁净凝集试管，依次加ml生理盐水,取1：400稀释的伤寒杆菌抗血清ml（血清稀释视抗血清效价而定,效价高稀释倍数就高,教科书上抗血清稀释倍数一般从1：40开始），加入1号管,混匀后,取ml加入2号管,混匀，取ml加入3号管,依次稀释,8号管混匀后吸ml弃去，10号管为对照管,从10号管开始,从后向前依次加入ml伤寒杆菌均“O”“H”菌悬液（7亿/ml）[1],各管混匀，置37℃静置24h,使抗原抗体充分反应，判断效价见表2，以呈现50%凝集，出现“++”（上清液稍浑浊，凝集物明显）的最高血清稀释倍数为血清的效价。表2：伤寒杆菌“O”、"H”抗血清凝集效价测定（略）菌液+%盐水-免疫6只家兔伤寒杆菌抗血清的平均几何效价，伤寒“O”抗血清为1：16060,“H”抗血清为1：25600（见表3）。将“O”“H”抗血清按一定比例混合后，血清适当稀释代替伤寒病人血清，可得到理想的实验结果。表3：伤寒杆菌“O”、"H”抗血清几何平均滴度免疫途径（略）实验注意事项：细菌的培养要无菌操作,不能混入杂菌。所选用的兔子要预先用伤寒杆菌“O”、“H”菌液做抗体检测，不能选用已有抗伤寒杆菌“O”、"H”抗体的兔子。在免疫兔子时注意注射器的灭菌消毒，针头是否堵塞。注射耳缘静脉时,先用酒精将耳缘静脉来回擦,使它充血增粗,易于注射。在两次耳缘静脉注射后,兔子可能会出现身体不适,有拉稀或耳朵腐烂等症状,可减少注射量和次数,等好些再注射。收集血清时,将血液置于干燥的培养皿中,放4℃冰箱过夜,次日用滴管吸取,避免震动,以免溶血影响血清质量。3讨论经过几届学生的实验，作者认为自制的抗血清实验效果好，使用方便，随用随取。这样避免了因实验材料的购买困难而影响实验课的开设，能保质保量地完成实验教学任务。经济效益较高，购买的抗血清价格昂贵且效价不高，而自制的抗血清不需要耗费太多的材料，可为学校节约实验经费。自制的伤寒杆菌抗血清还可用于血清学的凝集反应，即用已知的伤寒杆菌抗血清与伤寒杆菌菌悬液10亿/ml结合，形成抗原抗体复合物，使学生对抗原、抗体抽象的概念得以了解，也可以观察感觉到它的客观实在，是一个建立免疫学概念的好实验。参考文献：[1]扬履