抗真菌药物敏感试验

抗真菌药物敏感试验沈永年概述真菌感染的发病率,尤其是深部真菌感染的发病率逐渐增高大量新型抗真菌药物不断涌现临床耐药菌株的消灭抗真菌药物敏感实验为临床耐药菌株的发现，抗真菌药物的选择供应指导。概述抗真菌药物敏感实验方法是建立在抗细菌药物敏感实验方法基础之上由于真菌是一种高等的生物，其繁殖方式、生长周期、生长条件等均与细菌不同，因此抗真菌药物敏感试验始终是国内外学者讨论的难题。因此，实验方法多样化，但尚无通用的标准方法。美国国家临床试验标准委员会（NCCLS）从1992年起，制订了一系列针对抗真菌药物敏感实验的指导性文件，但目前仍不能适用于全部医学真菌的检测。抗真菌药敏试验目的指导抗真菌药物的选择测定抗真菌药物对致病真菌的敏感性，供应临床用药量及预后监测的参考筛选耐药菌株及研制对致病真菌有效的抗真菌药物供应临床应用常见术语最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）

MIC50，MIC90，MIC50％～80％最低杀菌浓度（minimalfungicidalconcentrationMFC）

MFC50，MFC90最低有效浓度（minimaleffectiveconcentration，MEC）抗真菌药敏试验方法药基法琼脂稀释法试管（液体）稀释法微量液体稀释法菌基法（琼脂集中法）

ROSCO抗真菌药敏纸片法E试验法（E－test）

酵母样真菌药物敏感试验酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验于1992年由美国国家临床试验标准化委员会（NCCLS）提出标准实验方案（M27－P）以来，几经修订，目前已由M27－A2取代。此外，其他药物敏感试验方法如琼脂稀释法，琼脂集中法，E试验法等时有应用。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)药液的制备

储存液：浓度至少为1280μg/mL或10倍于受试的最高浓度。储存液浓度需依据药物本身溶解性决定。氟康唑和5－氟胞嘧啶（5－FC）以灭菌蒸馏水溶解；酮康唑、伊曲康唑、两性霉素B、伏力康唑等采纳DMSO溶解。储存液分装后置－60℃保存。解冻后的储存液应在24h内使用，不得重复冻存使用。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)药液的制备

使用液：水溶性药物以无菌蒸馏水将储存液倍比稀释至工作液浓度（10倍测试浓度）。非水溶性药物则需将储存液用DMSO倍比稀释至100倍测试浓度，再采纳无菌蒸馏水稀释至工作液浓度（10倍测试浓度），以防止药物的析出。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)培育基的制备

2倍浓度RPMI1640培育基（不含NaHCO3）作为标准培育基，用0.33mol/LMOPS缓冲液溶解,调节pH值至6.9~7.1（室温），过滤除菌，4℃可保存4周。在培育基中加入4%葡萄糖可促进菌生长，帮助终点的推断。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)菌液的制备受试菌在SDA或PDA中35℃培育24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌）。取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采纳分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的贮备液。使用时，采纳2倍量培育基将菌液调整至工作浓度为1.0×103～5.0×103/mL。再用无菌蒸馏水倍比稀释成0.5×103～2.5×103/mL。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)实验步骤：取无菌的15mm×100mm试管进行实验在试管中依次加入0.1mL倍比稀释的不同浓度药物工作液。依次在试管中加入0.9mL菌工作液，混匀。注意整个过程需在15min内完成。实验过程中，设置空白对比和生长对比。同时进行质控菌株平行试验，进行质量掌握。将试管置于35℃培育46～50h观察结果。对于新生隐球菌，培育时间应延长至70～74h。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)结果判读两性霉素B终点的推断比较容易，无肉眼可见生长的最低药物浓度为两性霉素B的MIC值。氟胞嘧啶及唑类往往在最低浓度时也可消灭轻度浑浊。此时，可取生长对比管中菌悬液0.2mL，加入培育基0.8mL混匀作为推断终点的浊度（即80％菌的生长受到抑制时的浊度)，与此浊度相近的试管即可判定为终点，其药物浓度为该药的MIC值。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)结果的判定新三唑类药物酵母菌的MIC值为0.03~16μg/mL，大多数酵母菌的MIC值小于1μg/mL。目前尚无资料说明MIC值与临床疗效之间的关系。氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑判定标准如下表所示。氟康唑的判定标准不适用于克柔念珠菌。采纳不适当的溶媒溶解伊曲康唑可导致结果偏差。念珠菌体外药物敏感试验的结果判定标准

敏感（S）剂量依靠敏感（S－DD）中度敏感（I）耐药（R）氟康唑≤816~32≥64伊曲康唑≤0.1250.25~0.5≥1氟胞嘧啶≤48~16≥32注：如果测定的MIC值位于上述分类之间，则将该菌划分入高一级类别中试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)注意事项测试药物的浓度范围应包括终点浓度和质控株的MIC范围。一般常见药物的测试浓度范围：两性霉素B0.0313~16μg/mL；氟胞嘧啶0.125~64μg/mL；酮康唑0.0313~16μg/mL；伊曲康唑0.0313~16μg/mL；氟康唑0.125~64μg/mL，新三唑类药物（如伏力康唑等）0.0313~16μg/mL。试管液基稀释法

(NCCLS-M27A)注意事项测试过程中，需进行生长空白对比、空白对比、质控菌株对比。应选择对抗真菌药物无拮抗作用的缓冲液溶解RPMI1640培育基，如MOPS。Tris缓冲液、PBS缓冲液因可与药物存在相互作用而不适用。培育基pH值可能影响测试结果，应严格掌握pH值于6.9~7.1。微量液体稀释法药液（储备液和工作液）的制备储备液的制备同试管稀释法。与试管稀释法不同，微量稀释法的工作液浓度是测试浓度的两倍。培育基的制备：同试管稀释法菌液（储备液和工作液）的制备菌储备液的制备同试管稀释法，但工作液浓度稀释调整至两倍测试浓度（即1×103～5×103/mL）即可，不需再用无菌蒸馏水倍比稀释。微量液体稀释法试验步骤

1.药敏板的制备：采纳96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同浓度待测药物工作液100μl，第1孔为最高浓度，第10孔为最低浓度。制备好的药敏板可用塑料薄膜包裹后置－70℃保存6月以上。2.取制备好的药敏板，在1～10孔加入100μl菌工作液，第11孔中加入100μl无菌蒸馏水和100μl菌工作液，作为生长对比；12孔仅加入无菌不含药物培育基作阴性对比。3.将培育板置于35℃孵育48小时(新生隐球菌为72小时）后读取结果。微量液体稀释法

结果判读观察前，可轻轻震摇药敏板，使终点判读更容易。如果消灭菌膜沉淀，须进行吹打、涡旋或其他方法混匀后，在进行结果判读。结果判读以生长对比孔作为标准，将生长情况进行评分：0：完全透明清亮；1：轻度浑浊2：浊度较生长对比明显下降；3：浊度较生长对比轻度下降；4：浊度与生长对比全都。微量液体稀释法结果判读两性霉素B：以评分为0的最低药物浓度为MIC值5－FC和唑类：评分为2的最低药物浓度作为MIC值。通过分光光度计检测显示，此时大约50％菌生长受到抑制。结果判读可缩短至24小时，只要第11孔有菌生长即可进行，对结果无明显影响。琼脂稀释法

将琼脂平板中掺入不同浓度的抗真菌药物，以多点接种法将待测真菌接种于琼脂表面（各点所种真菌量相同），以菌不生长的最低药物浓度定为该药对真菌的MIC。优点：可同时测定多个菌株，易于确定终点。比液体稀释法重复性好。缺点：方法繁琐，耗时长。琼脂稀释法药液的制备：同试管液基稀释法，工作液浓度为10倍浓度的测试浓度，各种常用药物的浓度测试范围为：两性霉素B0.0313~16μg/mL；氟胞嘧啶0.125~64μg/mL

酮康唑0.0313~16μg/mL；伊曲康唑0.0313~16μg/mL

氟康唑0.125~64μg/mL

；

新三唑类药物（如伏力康唑等）0.0313~16μg/mL。

琼脂稀释法培育基制备RPMI1640培育基:

2倍量:RPMI164020.8g,葡萄糖40g,以0.33M

MOPS缓冲液溶解,调整pH值至6.9~7.1,过滤除菌,置-20℃保存。HR培育基：

2倍量：29.3gHR培育基，NaHCO3

2.0g，溶于1000mL双蒸水中，调整pH值至7.5，过滤除菌，低温保存。4％琼脂：

40g琼脂，溶于1000mL蒸馏水中，高压灭菌15min，备用。琼脂稀释法菌液的制备受试菌在SDA中35℃培育24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌）取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采纳分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的工作液。

琼脂稀释法药物平板的制备将RPMI1640培育基或HR培育基置60℃预温。取4％琼脂，加热融化后，置60℃，保温。将培育基和琼脂1:1混匀，分装入试管中，每管分装13.5mL，仍置60℃保温。将不同浓度药液（工作液）1.5mL加入试管中，轻轻震摇混匀，倒入平皿，置水平桌面使之凝固，注意混匀时避开消灭气泡。37℃，15分钟，使干燥。如采纳平板多点接种，可将培育基18mL，加入不同浓度药液2mL，混匀倒入9cm直径平皿，制成药物平板备用。琼脂稀释法接种和培育在药物平板中接种测试菌液，每点接种1～5μl，可进行多点接种。并设置生长对比平皿，空白对比平皿和标准菌株对比。37℃培育48h或72h（新生隐球菌）终点判定：确定生长对比菌生长良好，空白对比无污染菌生长。逐一观察从高浓度至低浓度平皿上的生长情况，以菌不生长平皿的药物浓度作为对该菌的MIC值。琼脂集中法

将待检菌掺入琼脂培育基内，将浸有固定浓度的抗真菌药液纸片置于琼脂培育基表面，经孵育后，依据纸片周围真菌生长被抑制的范围大小确定药物对真菌的抑制作用。如同时应用系列浓度纸片，尚可测出MIC值。优点：简洁、易行、不需简洁设备缺点：单一浓度纸片仅能定性，不能确定MIC值。药物纸片的标准化问题。琼脂集中法培育基制备基本培育基为MH琼脂，其中加入2%葡萄糖和亚甲基兰（0.5μg/mL）。调整pH值至7.2～7.4（室温下）。高压灭菌后分装入平皿，室温下冷却凝固后，37℃温箱中干燥10～30min，以去除平皿表面水蒸气。培育基平皿可在2～8℃冰箱保存一周。如采纳塑料袋包裹可适当延长。使用前，应抽取同一批次平皿置于30～35℃孵箱中24小时，以确定无污染。琼脂集中法药液纸片制备：商品化药液纸片：应保存于－14℃以下冰箱中。使用前，应提前取出置于室温中平衡1～2小时。

琼脂集中法菌液制备同试管稀释法，受试菌在SDA或PDA中35

℃培育24小时（念珠菌属）。取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采纳分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个浊度单位，相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的贮备液。琼脂集中法操作步骤：用棉签蘸取菌液涂于平板上，重复三次，每次将平板旋转60o再进行涂布，最后涂布平板边缘。将浸有药液的纸片贴于琼脂表面，可略微加压保证纸片与琼脂贴合紧密。纸片与纸片中心距离一般大于24mm。通常，150mm平板纸片数量不超过12个；100mm平板不超过5个。由于药物集中在接触时即已进行，因此，当纸片接触平板后即不行再移动。将贴有纸片的平皿翻转后置35℃培育20～24小时，观察结果。如24小时菌生长不良，可将培育时间延长至48小时。琼脂集中法结果判读药物对受试菌有生长抑制时，可围绕纸片形成抑制环。以明显受抑制的环边缘作为边界，测量抑制环大小。环边缘针尖大小菌落或环内的大菌落可忽视不计。琼脂集中法结果判定

质控菌株的参考值（mm）白念珠菌（ATCC90028）近平滑念珠菌（ATCC22019）热带念珠菌（ATCC750)克柔念珠菌（ATCC6258）氟康唑（25μg）28～3922～3326～37伏力康唑（1μg）31～4228～3716～25琼脂集中法结果判定：耐药剂量依靠敏感敏感抑菌环直径(mm)≤1415～18≥19MIC值(μg/mL)≥6416-32≤8念珠菌氟康唑琼脂集中法（25μg纸片）结果与MIC值对比抗真菌药敏纸片法

丹麦ROSCO公司从20世纪70年月开头研制抗真菌药敏纸片，操作简洁，结果直观，易于普及，只要严格依据ROSCO公司Neo－Sensitab抗真菌药敏纸片方法操作，可与NCCLS－M27p有很好的符合率。主要适用于酵母样真菌的药敏试验。该方法也是一种琼脂集中法。抗真菌药敏纸片法培育基采纳SHADOMY琼脂，用磷酸盐缓冲液调节pH至7.0，同时添加氯霉素掌握细菌污染。培育基高压灭菌后，倒入9cm培育皿中制成平板备用。ROSCO抗真菌药敏纸片分类合名称类别名称缩写剂量（μg）多烯类两性霉素BAMPHO10制霉菌素NYST50唑类酮康唑KETO15咪康唑MICO10克霉唑CLOTRI10益康唑ECON10氟康唑FLZ15伊曲康唑ITRA8伏力康唑VCR1异康唑ISO10噻康唑TIO10其他氟胞嘧啶FLU1010FLU11灰黄霉素GRIS25环吡酮胺CIC50特比萘芬TRB30抗真菌药敏纸片法菌液制备及操作步骤取沙堡琼脂上30℃培育48小时的待测酵母样菌半白金耳，磨种至生理盐水中，充分震荡后调整接种液菌浓度至5×105/mL，相当于0.5麦氏浊度单位。将菌液按前述方法用棉拭子涂布于培育基平板上，35℃培育18~24小时，观察结果。隐球酵母属真菌，30℃，42～48小时判读结果。基本判读标准（局部治疗用）抗真菌药名称敏感中介耐药环吡酮胺≥20mm12~19mm≤11mm克霉唑≥20mm12~19mm≤11mm益康唑≥20mm12~19mm≤11mm氟康唑≥20mm12~19mm≤11mm异康唑≥20mm12~19mm≤11mm酮康唑≥20mm12~19mm≤11mm咪康唑≥20mm12~19mm≤11mm噻康唑≥20mm12~19mm≤11mm特比萘芬≥20mm12~19mm≤11mm游霉素≥15mm10~14mm无抑菌环制霉菌素≥15mm10~14mm无抑菌环伊曲康唑≥15mm10~14mm无抑菌环灰黄霉素≥10mm无抑菌环严重系统性感染株判读标准药物名称抑菌圈直径（mm）Breakpoints，MIC（μg/mL）敏感中介耐药敏感耐药两性霉素B/10μg≥1514～10<10≤1≥4氟康唑/25μg≥2221～15≤14≤8≥64氟胞嘧啶/1μg≥2012～19≤11≤4≥32氟胞嘧啶/10μg≥3023～29≤22≤4≥32伊曲康唑/8μg≥1610～15≤9≤0.12≥1酮康唑/1μg≥3023～29≤22≤0.12≥0.5伏力康唑/1μg≥14≤1酵母纸片药敏的质控

（0.5麦氏浊度，1：1稀释，培育18～24h）药物名称直径（mm）白念珠菌（ATGG84548）白念珠菌（ATGG64550）光滑念珠菌2338NL（24h）两性霉素B18～28（s）19～24（s）9～13（s）氟康唑36～42（s）11～17（s）氟胞嘧啶34～40（s）26～33（s）45～53（s）伊曲康唑25～31（s）9（R）酮康唑36～44（s）21～29（I）E试验法琼脂集中法的改良，将原单一药物浓度纸片用含有梯度浓度排列的药液条代替，通过形成的椭圆形抑菌圈，可推断药物的MIC值。本法与琼脂稀释法比较，二者的符合率为95％，在提高试验的敏感度及削减实验步骤等方面有较大的优越性。E试验法培育基：RPMI1640或HR培育基，含2％琼脂和2％葡萄糖，制备过程同琼脂集中法，调节pH值至7.0,倒入平皿，冷却凝固，制成培育基平板。菌液：制备同琼脂集中法，调节菌液浓度至0.5麦氏浊度单位。E试验纸片：有商品供应。纸片上含有梯度浓度排列的药物。E试验法操作步骤

1.用棉拭子蘸取菌液涂布于培育基平板

2.将含不同药物的E试验药液塑料条贴于培育基上，150mm

平皿最多贴4～5个；90mm平皿最多贴1～2个。

3.

35℃培育24小时（念珠菌）或48小时（隐球菌属）后判读结果。

E试验法结果判读可见到呈椭圆形的抑菌圈，圈边缘所指示的相应位置的数值（药物浓度）即为MIC值。丝状真菌（双相真菌）

药物敏感试验由于丝状真菌生长较慢，体积较大，给丝状真菌的药物敏感试验带来很多困难。目前，丝状真菌的药物敏感试验无论是在培育基的选择、菌量的确定或终点推断上均无标准化的方法。因此，至今尚无重复性好、简洁易行、被广泛接受的标准化试验。一般常用的方法包括琼脂稀释法，液体微量稀释法等。琼脂稀释法培育基制备沙氏琼脂：葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水，调整pH至6.8，高压灭菌。

CAS培育基：Casitone9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水，高压灭菌。

琼脂稀释法菌液制备

1.将待测菌株接种于PDA上，28℃培育7～10天

2.取约5mg菌量，置于生理盐水中，Potter研磨器研碎，经四层无菌纱布过滤，以血细胞计数板计数分生孢子或碎菌丝成分，以灭菌生理盐水调节分生孢子或菌丝成分至103/mL。琼脂稀释法药物工作液的制备

参考酵母样菌试管液基稀释法的药液配制。药物工作液浓度是测试浓度的10倍。琼脂稀释法药物培育基制备

1.

以不同浓度的药物2mL加至18mL经56℃融化的琼脂中使之混匀，每个浓度药立即分别倒入直径9cm的培育皿中，待琼脂固化后，4℃冰箱中保存。也可采纳试管法，即不同浓度药物0.3mL，加入2.7mL培育基，倒入无菌试管制成斜面备用。

2.培育基中的药物最终浓度为：两性霉素B

0.03~64μg/mL唑类药物0.125~128μg/mL特比萘芬0.03~128μg/mL阿莫罗芬0.01~100μg/mL琼脂稀释法操作步骤

1.取不同菌液以多点接种法接种入培育基，每点为1～5μl菌液。

2.

28℃，培育3～7天。

3.培育期间，每24小时读结果1次，以肉眼判定无菌生长的最低药物培育皿的浓度为MIC。微量液体稀释法培育基制备同酵母样菌试管液基稀释法，采纳含0.33MMOPS的RPMI1640培育基，pH6.9~7.1药液制备：同酵母样菌试管液基稀释法，储存液浓度至少为1280μg/mL。工作液浓度为2倍测试浓度。微量液体稀释法菌液制备

1.受试菌株在PDA上35℃培育7天，促进小分生孢子生成（镰刀菌属先在35℃培育48～72小时，然后25～28℃培育至7天）。

2.

1mL无菌生理盐水冲洗菌落，曲霉菌落可在无菌生理盐水中加入1滴吐温20。

3.收集冲洗液，静置3～5分钟，取上部较均匀混悬液，涡旋混匀，分光光度计测定OD值。曲霉和申克孢子丝菌调整OD值至0.09~0.11;根霉、镰刀菌及波氏假阿什利菌调整至0.15~0.17。

4.将上述悬液用培育基进行1:50稀释，即得到工作液（2倍最终浓度），约为0.4×104～5×104cfu/mL。微量液体稀释法试验步骤

1.采纳96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同浓度待测药物工作液100μl，第1孔为最高浓度，第10孔为最低浓度。

2.在1～10孔加入100μl菌工作液，第11孔中加入100μl无菌不含药物的培育基和100μl菌工作液，作为生长对比；12孔仅加入无菌不含药物培育基作阴性对比。

3.培育板置于35℃孵育。根霉在培育21～26小时后，镰刀菌、曲霉和孢子丝菌在46~50小时，波氏假阿什利菌70～74小时后读取结果。微量液体稀释法结果判读结果判读以生长对比孔作为标准，将生长情况进行评分。

0：完全透明清亮或无生长；

1：少量生长，大致相当于生长对比孔的25％

2：生长明显削减，相当于生长对比孔50％

3：生长轻度削减，相当于生长对比孔75％

4：无明显生长抑制，与生长对比全都微量液体稀释法结果判读

1.两性霉素B终点易推断，