兰花DNA的优化提取开题报告

兰花DNA的优化提取1.立题依据1.1论文题目及研究领域1.1.1论文题目:兰花DNA的优化提取1.1.2研究领域:在分子遗传的应用论文研究的理论意义及应用价值兰花一般是指兰科植物(Orchlidaceae)，它包括五个品种春兰(Cymbidiumgoe-ring)、蕙兰(Cymbidium)、寒兰(CyambidumMakion)、墨兰(Cymbidiumsinense)建兰（Censifoli-um）它是鲜花植物中最大科之一，全世界约有800多属，25000多种，分布于世界各地，大多数种类分布于东南亚、澳大利亚、中南美洲、非洲和马达加斯加。我国的野生兰科植物约有173属，1240多种，在南北各地均有分布，但以云南、台湾、海南最为丰富。因而鉴别起来比较困难，而现在采用分子标记进行兰花品种鉴别是一种比较有效的方法，而进行分子标记实验时，DNA的浓度和纯度的要求都是相当严格的。1.3目前研究的概况和发展趋势迄今为止，国内外报道的植物DNA提取方法多达好几十种，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[4]，十二烷基磺酸钠(SDS)法[1]，高盐低pH法[1]，碱裂解法[3]，Zigenhagen法[7]，脲法[6]，DraperandScott法[9]，Csclgradient法[7]，CTAB/Csclgradient法[5]，苯酚法[14]，DNAzolpeagent法[12]。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)方法和SDS(十二烷基磺酸钠)方法是目前最常用的两种[9]，它们都是一种强去污剂。CTAB具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和除大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，因此，CTAB可以用于从大量产生粘性多糖的植物制备纯化DNA[13]。而SDS可使细胞膜及核膜破裂，因此被用来分离DNA[11]。该分离过程的第一步是用热的去污剂(SDS)进行抽提物置于0℃2.论文研究的内容2.1论文重点解决的问题2.2论文拟开展的几个大方面2.2.1SDS方法和CTAB方法提取2.2.2实验结果分析2.2.3结果讨论2.3论文拟得出的主要结论选择出兰花的优化提取方法（SDS方法或CTAB方法）3．论文拟采用的研究方法3.1拟采用的主要研究方法用SDS和CTAB方法提取兰花DNA，并进行比较，通过实验结果来选择兰花的优化提取方法。3.1.1实验材料都江堰市西川花卉市场购买的材料兰花包括春兰(Cymbidiumgoe-ring)、蕙兰(Cymbidium)、寒兰(CyambidumMakion)、墨兰(Cymbidiumsinense)。3.1.2实验仪器天平、研体和研棒、恒温水浴锅、冰盒、泠冻离心机、冰箱、微量离心移液器、微量离心机、50ml离心管等。3.1.3实验试剂液氮、TBE缓冲液、异丙醇、1×CTAB缓冲液、氯仿/异戊醇(24：1)、0.2mol/ml乙酸纳、5×TBE缓冲液等。3.1.4实验方法3.1.4.11×CTAB法提取兰花DNA（1）将2g新鲜兰花叶片用液氮速冻，然后在研体中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至50ml聚丙烯离心管中，然后加入20ml预热至90度的1×CTAB提取一离心管中提取缓冲液。轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置40分钟。（2）混合物泠至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。轻轻颠倒离心管几次使管内混合物构成乳状液。室温5000转/分钟离心10分钟分相。（3）将上清液(水相)转移至一干净离心管中，37℃保温30分钟。（4）加入0.7体积的异丙醇，仔细混匀，室温放置15分钟沉淀DNA。（5）用一玻璃钩将DNA钩出，并转移至一装有50ml70%乙醇，0.2mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置20分钟，然后转移至一装有5ml70%乙醇的离心管中，冰上旋转5分钟。（6）将DNA转移至一干净离心管中，空气干燥10分钟，溶于尽可能少的TE缓冲液(可多达5ml。视DNA的量和纯度而定),4℃保存3.1.4.2SDS法提取兰花DNA（1）将2克新鲜兰花的叶片置于液氮中速冻，然后在研体中将其磨碎，将泠冻粉末转移至50ml离心管中加入15ml提取缓冲液。轻轻旋转混匀。（2）加入1ml20%SDS，混匀，65℃保温10分钟，并不时轻旋转混匀。（3）加入5ml5mol/L乙酸钾，混匀后冰上放置20—30分钟。用14000r/min度离心25分钟。上清波用纱布过滤，转移至一干净的50ml离心管中，加入10ml异丙醇，轻轻颠倒混匀，－20℃放置40分钟沉淀核酸。（4）然后，在4℃条件下，以2000r/min进行离心，离心20分钟，去上清液，晾干沉淀5分钟。用700ul5×TE缓冲液溶解沉淀并转移至一Eppendorf管中。加入75ul3mol/LKAc,轻弹混匀，离心15分钟沉淀不溶性杂质。（5）将上清液转移至一装有500ul异丙醇的干净管中，轻轻混匀，室温下放置5min。微型离心机离心15分钟沉淀DNA，去上清液并用500ul70%乙醇清洗沉淀。再次离心5min，吸去乙醇。沉淀物溶解于200ulTE缓冲液中，4℃保存。3.1.5数据统计与结果分析不同方法提取兰花DNA的提取率及A260/A280值(表1)方法MethodA260/A280∑/3浓度/(ug/ul)S1S2S3C1C2C3C4_____________________________________________________________________3.2实验进度安排日期安排内容备注2006年9月1—15日选题已完成2006年9月21日—10月查阅资料已完成2006年10月8月—2007年2月实验实施已完成2007年2月—2007年6月毕业论文撰写已完成4．文献查阅及文献综述兰花DNA的优化提取孟超（四川农业大学职业技术师范学院，资源与环境系，生物技术专业，611830）范志霞（四川农业大学职业技术师范学院，资源与环境系，611830）摘要：我国的兰花品种繁多，因而鉴别起来比较困难，而现在我们采用分子标记进行兰花品种鉴别是一种比较有效的方法，因而在进行分子标记实验时，DNA的浓度和纯度的要求都是相当严格的。因此，本实验采用SDS方法和CTAB方法分别对兰花的四个品种春兰(Cymbidiumgoe-ring)、蕙兰(Cymbidium)、寒兰(CyambidumMakion)、墨兰(Cymbidiumsinense)进行DNA提取并进行比较，结果表明SDS方法是这几种兰花DNA的优化提取法。关键词：兰花；DNA；SDS；CTAB；优化提取自2O世纪8O年代初，分子生物学大量运用于植物研究领域后，DNA分子标记不仅在农业上对植物选种、育种和改良等方面的应用稳步增长，而且在中药资源、鉴定、栽培等方面也有着很好的发展前景。在一般情况下，DNA分子标记技术涉及的分子生物学原理比较简单，实验方法也不复杂，但熟练掌握、灵活运用，并有效地解决实验中出现的各种情况，仍有许多问题值得重视。其中，如何有效地提取高质量的植物DNA已成为生物化学研究的一个重要方面。DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA的提取应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效地完成DNA提取，那就无法进行分子生物学方面的实验。植物DNA的有效提取，根据不同研究需要，应保证结构的相应完整性；应尽量排除其他大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；应保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子，尽可能少地降解。提取DNA的质量一般采用核酸蛋白质分析仪检测。植物DNA的有效提取，它是进行任何DNA工作的前提和基础，也是最关键的一步。自1980年以来，KerryMullis发明了PCR技术，分子生物学大量运用于植物研究领域后，DNA分子标记不仅在农业上对植物选种、育种和改良等方面的应用稳步增长，而且在花卉资源、鉴定、栽培等方面也有着很好的发展前景[5]。在一般情况下，DNA分子标记技术涉及的分子生物学原理比较简单，实验方法也不复杂，但熟练掌握、灵活运用，并有效地解决实验中出现的各种情况，仍有许多问题值得重视，如提取DNA的质量它直接影响后面的实验流程。参考文献:[1]熊劲芳,向育君,张正奇．花生总DNA的快速提取与纯化研究[J]．生物学杂志，2003，20(2)：32—34[2]赵艳丽,刘国琴．一种快速提取小麦DNA的方法．郑州工程学院学报[M]，2002，23(3)：62—65.[3]陈心启．中国兰花全书[M]．北京：中国林业出版社，1998．246—256[4]洪付祥,熊金森,熊玲嫒．鹤望兰基因组DNA的提取方法[J]应用与环境生物学报，2002，8(4)：366—370[5]邵碧英,陈文炳,李寿崧等．转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析[J]．厦门大学报(自然科学版)，2002，41(5)：674—678[6]孙晓东,李小丹,郭晏海.经济植物DNA提取与纯化的三种方法比较[J]．陕西教育学院学报，2003，19(5)：93—94[7]陈庆山，刘春燕,吕东,何建勋．大豆DNA提取基本原理的探讨．东北农业大学学报[M]，2004，35(2)：129—134[8]胡薇,孙端,潘晓华．建兰DNA的快速提取[J]．福建师范大学学报(自然科学版)，2004，20(1)：1l8—120[9]沈向，郑学勤，任小林，等．核果类基因组DNA提取和RAPD条件优选．山东农业大学学报(自然科学版)[M]，1999．30(2)：154—160[10]王关林，方宏筠．植物基因工程(第2版)[M]．北京：科学出版社．2002．742-749[11]王齐红,黄骥,张红生．一种快速微量提取植物叶片DNA的方法．生物技术通讯[M]，2004，15(5)：479—480[12]王景雪,孙毅,高武军．一种简便实用的植物总DNA提取方法．山西大学学报(自然科学版)[M]，2000，23(3)：271—272[13]张七仙,刘俊起,李成霞,张秀君,赵倩,于静娟,敖光明．一种简捷的同时提取植物总DNA和总RNA的方法．中国农业科学[J]，2001，34(4)：458—460[14]应天玉,杨有,袁玉峰．一种快速的植物DNA制备方法．东北林业大学学报[M]，2003，31(2)：6l一62[15]FangG，HammarS，GrumetR．AquickandinexpensivemethodforremovingpolysaccharidesfromplantgenomicDNA[J]．Biofeedback，1992，13(1)：52—54[16]ProberkiSL，BaileyG，BaumRB．ModificationofaCTABextractionprotocollforplantcontaining