提取与沉淀分离技术

用于生物化学大分子研究的独特的分析、制备技术生物化学实验技术的主要特点是：①操作温和，使对所研究组分的天然结构和功能的损害，尽可能减少至最小。②微量分析，低达ng或pg水平；或大量分离制备，高达公斤级。③分辨率高，可明确区分结构或性质极其相似的物质。

现代生物化学实验技术，按其目的和性质分为三大类。

一、按不同的物理化学性质进行分析鉴定和分离制备，其中又可分为五类

①根据分子的大小进行分辨者，有凝胶过滤法、超速离心法、超滤法、SDS电泳分析等。②根据分子荷电情况进行分辨者，有等电聚焦电泳法、离子交换层析法等。③根据吸收光谱和放射性等性质进行分辨者,有紫外/红外/荧光分光光度法、X射线结构分析法、电子顺磁共振,电子自旋共振和核磁共振法,以及放射性核素示踪和放射免疫分析法等。④根据疏水相互作用或氢键形成的引力进行分辨者，有反相高效液相层析、分子杂交技术等。⑤根据特异相互作用进行分辨者，有亲和层析、免疫化学分析法等。

二、经一系列不同的化学和物理方法处理，以求得差异分辨，或按指令合成不同的高分子物质。如氨基酸序列分析和序列合成、核苷酸序列分析和序列合成等。三、有目的地对DNA进行剪切拼接，引入细胞中的（或分子克隆技术）等。

细胞破碎定义

从含有多种组分的混合物中将某种生化物质与其他物质分离的技术目的缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率

新趋势——高效集成化

1继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术；2进行各种分离技术的高效集成化。第一篇生化分离技术定义采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.第一章提取与沉淀分离技术第一节细胞破碎细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌：肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：细胞壁更厚植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁具有很高的机械强度细胞破碎技术一机械破碎法

通过机械运动产生的剪切力作用使细胞破碎的方法。分为捣碎法、研磨法和匀浆法1.1捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。如叶绿体的分离常用于动物内脏、植物叶片等较脆嫩的组织细胞；微生物细胞破碎也可以使用1.2匀浆法影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.高速珠磨机研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机1.3研磨法2.1反复冻溶法原理：反复冻融过程中，由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为黏稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。方法：将待破碎的细胞于冷藏库或干冰反复于零下15-20℃使之凝固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。

特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。

二物理破碎法物理法破碎细胞主要通过各种物理因素使组织细胞破碎。将材料投入沸水中，维持90℃左右维持数分钟，立即置于冰水浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。2.2冷热更替法2.3压力差破碎法通过压力的突然变化，使细胞破碎。高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。

破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。

2.4超声波处理

存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。

而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。三化学破碎法某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。

作用机理：化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。

特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。

存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。四酶促破碎法利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8mol/L尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。存在的问题：易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步纯化带来困难。特点：

a、此法适用多种微生物；

b、具有作用条件温和；

c、内含物成分不易受到破坏；

d、细胞壁损坏的程度可以控制

五选择破碎方法的依据(1)细胞的处理量(2)细胞壁的强度和结构(3)目标产物对破碎条件的敏感性(4)破碎程度适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡六破碎技术研究的方向(1)多种破碎法的结合(2)与上游技术结合(3)与下游操作技术结合第二节提取定义：一定条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程。也称为抽提。一提取方法1.1盐溶液提取盐溶/盐析：低盐下，蛋白质溶解度随盐浓度的升高而增加/盐浓度达到某一界限后，蛋白质溶解度随盐浓度升高而下降。低盐—蛋白质提取—0.02-0.5mol/L高盐—蛋白质沉淀1.2酸溶液提取酸性条件下，溶解度大、稳定的物质使用PH不能太低，以免失活；一般PH3-61.3碱溶液提取碱性条件下，溶解度大、稳定的物质使用PH不能过高，以免影响酶活性；1.4有机溶剂提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的蛋白质，采取与水可以混溶的乙醇、丙酮等有机溶剂提取；

DNA和RNA可以采用苯酚水溶液提取：

DNA、蛋白质-苯酚层

RNA、多糖-水层二影响因素

2.1溶解度相似者相溶，物质极性、温度、PH2.2扩散速度温度、溶液黏度、扩散面积、扩散距离、两相浓度差2.3提取液体积提取液总量一般为原料体积的3-5倍第三节沉淀分离定义：经沉淀反应使不同组分相互分离的方法一般做法是控制适当的pH值，加入沉淀剂使少数几种组分首先沉淀，过滤分离后重新调节pH值，加入另种沉淀剂使另外少数几种组分生成沉淀。如此依次沉淀和分离后，可将复杂试样中的各组分分成若干组，使得复杂的分析问题变得较简单。盐析/有机溶剂沉析/等电点沉析/有机聚合物沉析/其他沉析技术一盐析原理溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。

影响盐析的因素（一）盐离子浓度在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子表面电荷，使生物分子水合作用增强，具有促进溶解的作用，称盐溶现象。当盐浓度达一定值后,盐浓度升高，生物分子溶解度不断降低,产生了盐析作用,不同的生物分子，“盐溶”与“盐析”的分界值不同。

（二）生物分子种类生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基团与疏水基团不相同，不同生物分子产生盐析现象所需中性盐的浓度（离子强度）亦不同。（三）生物分子浓度溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的影响，要得到理想的沉析效果，必须将生物分子的浓度控制在一定的范围内。一般对于蛋白质溶液，其浓度为2%～3%比较合适。（四）pH值在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶液的pH值调整到该成分的等电点，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液的pH值偏离该成分的等电点。（五）温度多数物质的溶解度会受温度变化的影响。

盐析的操作与应用（一）盐析的操作1、盐的处理硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。2、加盐的方法（1）直接加入固体硫酸铵法（2）加入饱和硫酸铵溶液法3、盐析操作注意事项（1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离。（2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进行第二次盐析要靠试验确定。（3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控制。

（4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长的离心时间。

（5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。

（二）盐析的主要应用

盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能达到很好的分离效果。由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的分离纯化。

二等电点沉析等电点沉析原理调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低

等电点沉析的注意事项（一）等电点的改变（二）目的物的稳定性（三）盐溶作用（四）pH的调节

等电点沉析的应用（一）在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化。（二）等电点沉析只适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等电点(pH=5.4)附近,难溶于水，能产生沉析。

三有机溶剂沉析原理（一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。（二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸引而聚集。

影响有机溶剂沉析的因素（一）温度大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0℃以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过浓。温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发。（二）生物样品的浓度

与盐析相似，样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降。一般认为，对于蛋白质溶液0.5%-2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%-2%为起始浓度为宜。（三）pH有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生。（四）离子强度在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。盐的浓度太大(0.1-0.2mol／L以上)，就需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止变性。（五）金属离子在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到某些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+、Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量，0.005-0.02mol／L的Zn2+可使有机溶剂用量减少l／3至1／2,使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根)的存在。

有机溶剂沉析的应用（一）有机溶剂沉析的特点优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

（二）应用

有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉析所得的