医学紫外可见分光光度法N

紫外可见分光光度法N第一节概述一、紫外-可见分光光度法利用某些物质分子对紫外-可见光的吸收来进行分析测定的方法波长？吸收程度？l、I0l、I第一节概述一、紫外-可见分光光度法利用某些物质分子对紫外-可见光的吸收来进行分析测定的方法波长？吸收程度？l、I0l、I二、紫外-可见吸收光谱吸收光谱(曲线)吸光物质对光的吸收程度(吸光度)与波长间的关系曲线测量吸光物质对不同波长紫外-可见光的吸收程度(吸光度)，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得到的谱图称该物质的吸收光谱。宽带光谱第一节概述一、紫外-可见分光光度法物质分子对紫外-可见光的吸收二、紫外-可见吸收光谱吸收光谱(曲线)吸光度与波长间的关系曲线三、紫外-可见吸收光谱中的常用术语lmax吸光度最大的地方所对应的波长能在紫外-可见光范围内产生吸收的基团与生色团连接时，能使生色团的吸收峰向长波长方向移动的基团化合物吸收峰向长波长方向移动的现象化合物吸收峰向短波长方向移动的现象化合物吸收强度增强的现象化合物吸收强度减弱的现象1.最大吸收波长5.其它2.生色团和助色团3.红移和蓝(紫)移4.增色效应和减色效应第二节朗白-比尔定律一、Lambert-Beer定律

当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。k与溶液性质、温度和入射光波长有关二、吸光系数k的单位与名称c：g·L-1、l：cma：L·g-1·cm-1吸光系数c：mol·L-1、l：cme：L·mol-1·cm-1摩尔吸光系数c：g·(100mL)-1、l：cm比吸光系数第二节朗白-比尔定律一、Lambert-Beer定律二、吸光系数吸光系数、摩尔吸光系数、比吸光系数cA三、偏离Lambert-Beer定律的因素吸光分子电荷分布间的相互作用各种样品组分分子间的相互作用如何避免？样品对光的散射作用1.与样品溶液有关的因素稀溶液真溶液入射光为复合光单色器性能2.与仪器有关的因素如何避免？测定波长附近吸收曲线应较平坦最大吸收波长lmax第三节紫外-可见分光光度计为光度测定提供足够强度的、稳定的入射光第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成吸收池光源检测器单色器信号显示系统将光源发出的复合光分解为单色光盛放试样并位测量提供合适的光程将光学信号转换为电学信号的设备第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件为光度测定提供足够强度的、稳定的入射光连续光源线光源a.紫外光源氢灯或氘灯160-375nmb.可见光源卤钨灯或钨丝灯320-2500nm1.光源第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器将光源发出的复合光分解为单色光棱镜、光栅a.棱镜入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝非匀排光谱棱镜单色器玻璃和石英色散第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器将光源发出的复合光分解为单色光棱镜、光栅a.棱镜b.光栅闪耀光栅dθαβ入射狭缝出射狭缝反射光栅凹面镜光栅单色器匀排光谱光栅公式衍射第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅单色器的性能指标色散率角色散率线色散率分辨率将两条邻近谱线分开的能力光谱带宽有效带宽D：倒线色散率（n

mm

m-1）W：狭缝宽度（m

m）第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅盛放试样并位测量提供合适的光程3.吸收池可见区玻璃比色皿紫外区石英比色皿响应光谱范围：300-800nm第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅3.吸收池紫外区：石英比色皿，可见区：玻璃比色皿将光学信号转换为电学信号的设备a.硒光电池疲劳4.检测器第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅3.吸收池紫外区：石英比色皿，可见区：玻璃比色皿将光学信号转换为电学信号的设备4.检测器a.硒光电池b.光电管响应光谱范围及灵敏度与光敏材料有关第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅3.吸收池紫外区：石英比色皿，可见区：玻璃比色皿将光学信号转换为电学信号的设备4.检测器a.硒光电池b.光电管灵敏度高响应时间短c.光电倍增管第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅3.吸收池紫外区：石英比色皿，可见区：玻璃比色皿将光学信号转换为电学信号的设备4.检测器a.硒光电池b.光电管c.光电倍增管d.硅二极管阵列lA第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.光源紫外区：氢灯或氘灯，可见区：卤钨灯或钨灯2.单色器棱镜、光栅3.吸收池紫外区：石英比色皿，可见区：玻璃比色皿将光学信号转换为电学信号的设备4.检测器a.硒光电池b.光电管c.光电倍增管d.硅二极管阵列lAe.电荷转移器件多道检测器电荷偶合器件CCD第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.单光束分光光度计三、紫外可见分光光度计的类型最简单的一类光度计结构简单、操作方便、易于维修稳定性差吸收池光源检测器单色器信号显示系统第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.单光束分光光度计三、紫外可见分光光度计的类型结构简单、操作方便、易于维修稳定性差2.双光束分光光度计自动消除光源和检测器不稳定引起的误差第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.单光束分光光度计三、紫外可见分光光度计的类型结构简单、操作方便、易于维修稳定性差2.双光束分光光度计消除光源和检测器不稳定引起的误差3.双波长分光光度计消除背景干扰切光器第三节紫外-可见分光光度计一、紫外可见分光光度计的组成光源、单色器、吸收池、检测器二、紫外可见分光光度计的主要部件1.单光束分光光度计三、紫外可见分光光度计的类型结构简单、操作方便、易于维修稳定性差2.双光束分光光度计消除光源和检测器不稳定引起的误差3.双波长分光光度计消除背景干扰，结构复杂、价格高分离分析仪器的检测器多通道检测器4.多道分光光度计第四节分析条件的选择一、仪器测量条件的选择lA最大吸收波长lmax灵敏度高测量误差小1.入射光波长0.15~1.00A=0.434时，吸光度读数误差最小对于特定光度计，DT/T为常数2.吸光度读数范围二、显色反应条件的选择显色反应产物组成恒定、稳定；e大、选择性好；对照性好1.显色即用量2.溶液酸度3.显色时间4.显色温度第四节分析条件的选择一、仪器测量条件的选择最大吸收波长lmax灵敏度高测量误差小1.入射光波长A=0.434时，吸光度读数误差最小2.吸光度读数范围二、显色反应条件的选择三、参比溶液消除溶液中其它组分、吸收池和溶剂对光的反射和吸收保证吸光度真正反映样品中待测物含量1.溶剂参比2.试剂参比3.试样参比4.平行操作溶液参比四、干扰及消除方法1.控制酸度2.掩蔽3.解蔽4.选择适当测量波长5.分离第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用在相同条件下测定样品和标样的紫外可见吸收光谱，比较吸收线轮廓及最大吸收波长处的摩尔吸收系数

max二、结构分析1.判断顺反异构体2.判断互变异构体第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用定量依据：朗白-比耳定律a.标准对比法单点校正法cscxcs和cx应很接近1.单组份定量分析如何准确确定k？例：已知用1cm比色皿，在260nm处测得1.00

10-3molL-1强心药托巴丁胺（M=270）的吸光度A为0.700。取一片该药溶于水并稀释至1L，静止后取上层清液用1.00cm吸收池，于260nm波长处测得吸光度为0.350，计算该药片中含托巴丁胺多少克？第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用定量依据：朗白-比耳定律1.单组份定量分析如何准确确定k？b.标准曲线法工作曲线法c1c2c3c4c5cxa.标准对比法单点校正法A1A2A3A4A5AX第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用定量依据：朗白-比耳定律1.单组份定量分析如何准确确定k？b.标准曲线法工作曲线法a.标准对比法单点校正法试液编号1#2#3#4#5#6#未知Fe标准溶液/mL02.04.06.08.010.05.0盐酸羟胺/mL1111111NaAc/mL5555555邻菲罗啉/mL3333333总体积/mL50505050505050A00.1200.2380.3620.4840.5970.382C(Fe)=10mg/mL问题3.2紫外-可见分光光度法如何进行定量分析？例：称取0.432g铁铵矾[NH4Fe(SO4)2·12H2O]溶于水，再定容到500.0mL。取不同量标准溶液于50.0mL容量瓶中，加显色剂定容后，测定其吸光度，结果见下表。测定某试液铁含量时，吸取试液5.00mL，稀释至250mL，再取此稀释液2.00mL置于50mL容量瓶中，在上述相同条件下显色定容，测得吸光度为0.450，计算试液中铁含量(以g·L-1表示)

V(Fe)/mL1.002.003.004.005.006.00A0.0970.2000.3040.4080.5100.618解：根据列表数据做标准曲线××××××由样品溶液A=0.450，从标准曲线上查得：V=4.40mL稀释后的样品溶液中铁含量为：(g·L-1)试液中铁含量为：(g·L-1)定量依据：吸光度加和性等吸收点法系数倍率法标准对比法，标准(工作)曲线法第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用1.单组份定量分析2.多组份定量分析标准对比法，标准(工作)曲线法第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用1.单组份定量分析2.多组份定量分析例：用分光光度法测定含有两种配合物x与y的溶液的吸光度，获得下表数据(l=1.0cm)，计算未知溶液中x与y的浓度。溶液浓度c/(mol∙L-1)A1(l1=285nm)A2(l2=365nm)x5.0×10-40.0530.430y1.0×10-30.9500.050x+y0.6400.370在多个波长下测A，建立方程组，求解常用于高含量组分的测定cscx以标准溶液为参比，测定样品吸光度A可有效减小浓度测定的相对误差AsAx标准对比法，标准(工作)曲线法第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用1.单组份定量分析2.多组份定量分析在多个波长下测A，建立方程组，求解3.示差分光光度法常用于高含量组分的测定标准对比法，标准(工作)曲线法第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析紫外-可见分光光度法的最主要应用1.单组份定量分析2.多组份定量分析在多个波长下测A，建立方程组，求解3.示差分光光度法提高分辨率；消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收4.导数分光光度法标准对比法，标准(工作)曲线法第五节紫外-可见分光光度法的应用一、定性分析仅作为辅助手段使用二、结构分析三、定量分析解联立方程四、配合物组成及其稳定常数的测定紫色、红色、黄色三种配合物1.摩尔比法2.等摩尔连续变化法五、酸碱离解常数的测定第六节紫外-可见吸收光谱的产生一、紫外-可见吸收光谱的产生实现能量交换波长/nm<0.0050.005~1010~200200~400400~800分区名称g射线X射线真空紫外近紫外光可见光波长/mm0.8~2.52.5~5050~10001~300mm>300mm分区名称近红外光中红外光远红外光微波无线电波1.电磁波的能量第六节紫外-可见吸收光谱的产生一、紫外-可见吸收光谱的产生实现能量交换1.电磁波的能量2.分子的能量量子化n0n1V1V2V3EJ1J23.分子的能级跃迁UV-VisIR化合物分子吸收特定波长的电磁波引起分子能级跃迁4.分子吸收光谱的产生5.紫外吸收光谱的产生宽带光谱第六节紫外-可见吸收光谱的产生一、紫外-可见吸收光谱的产生吸收紫外-可见光，电子能级跃迁二、有机化合物的紫外-可见吸收1.有机化合物中的电子轨道及其跃迁s键s、s*轨道p键p、p*轨道孤对电子n轨道σEπnπ

*σ*σ~σ*跃迁n~σ*跃迁π~π*跃迁n~π*跃迁>>>2.有紫外-可见吸收的有机化合物含p键的有机物含非键电子的不饱和有机物共轭体系杂原子第六节紫外-可见吸收光谱的产生一、紫外-可见吸收光谱的产生吸收紫外-可见光，电子能级跃迁二、有机化合物的紫外-可见吸收三、无机化合物的紫外-可见吸收共轭体系，含杂原子Fe3+-SCN‾Fe2+-SCN电子接受体电子给予体配位化合物中心离子d或f分裂引起的吸收光谱1.电荷转移光谱2.配位体场吸收光谱第六节紫外-可见吸收光谱的产生一、紫外-可见吸收光谱的产生吸收紫外-可见光，电子能级跃迁二、有机化合物的紫外-可见吸收三、无机化合物的紫外-可见