单克隆抗体技术

单克隆抗体技术汇报人：陈海云吴亚荣指导老师：余为一主要内容： 一、概念 二、单克隆抗体的原理 三、单克隆抗体的制备 四、单克隆抗体的应用

1975年Kohler&Milstein创立单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学和生理学奖创立者：一、概念多克隆抗体（PcAb）：病原微生物和天然抗原含有多种抗原决定簇，刺激机体免疫系统后，可形成针对不同抗原决定簇的混合抗体。单克隆抗体（mAb)：单个淋巴细胞克隆产生，针对一种特定抗原决定簇的抗体。

单抗和多抗产生区别小鼠多克隆抗体（PcAb）与单克隆抗休（McAb）的比较项目PcAbMcAb抗体的制备用免疫血清用杂交瘤技术抗体的浓度0.1-1.0mg/ml（血清）10-100μg/ml(培养上清)1-10mg/ml（血清）5-20mg/ml（腹水）均一性抗体组成复杂抗体组成单一特异性抗体批间有差异抗体批间无差异识别的抗原决定簇多单一二、基本原理三、制备流程：材料准备实验动物：

与骨髓瘤细胞供体同一品系的动物（BALB/c小鼠6-8周龄20-25g）

抗原：可溶性抗原或颗粒性抗原B淋巴细胞：小鼠脾脏骨髓瘤细胞：与实验小鼠同一品系的动物细胞株保持HGPRT缺陷状态。常用骨髓瘤细胞SP2/0、NS1等。材料准备饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞、胸腺细胞。作用营养作用

清洁作用细胞融合方法骨髓瘤细胞B细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞-B细胞B细胞-B细胞B细胞骨髓瘤细胞融合筛选杂交瘤细胞方法：电融合激光融合离心融合灭活的病毒融合聚乙二醇融合法脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为3:1或5:1,最为常用。大概1-2周后，小鼠腹部会膨胀，抽取小鼠腹水，可获得大量单克隆抗体。体内培养法体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，收集培养上清液，离心去除细胞碎片，可获得单克隆抗体。杂交瘤细胞的筛选1杂交瘤细胞的筛选2单克隆抗体的应用筛选原理在实际免疫过程中，一种抗原决定簇只能刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞细胞DNA合成途径1.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸

2.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT酶3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）TK酶HAT选择培养基的组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂，是细胞合成DNA的阻断剂。

正常B细胞利用HAT培养液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶

(TK)的催化下经旁路合成DNA。

骨髓瘤细胞是遗传基因缺陷型的细胞系，缺乏HGRPT或TK。HGRPT酶TK酶杂交瘤细胞的选择性培养细胞生长情况融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体四、抗体的检测筛选：免疫酶技术——间接ELISA免疫荧光技术ELISA原理将抗原包被于酶标板，与待检杂交瘤细胞上清液反应，如该上清液中含有特异性的抗体（一抗Ab），即可与酶标二抗作用，加底物经酶催化呈现颜色反应，通过检测OD值判定结果。杂交瘤细胞的克隆化目的：建立单一细胞的克隆方法：有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔计数0.1ml/孔单克隆抗体的应用医学上用作诊断试剂1鉴别淋巴细胞2鉴别病原体，诊断传染病3肿瘤的诊断和分型4激素类单抗用于判断内分泌的功能状态单克隆抗体的应用用作研究工具1.纯化抗原2.