细胞培养技术

第十二章细胞培养基本技术

从机体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存、生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养概念细胞培养目的和作用基础研究1)药物作用机理2)基因功能3)疾病发生机理生物制药1)疫苗生产2)基因工程药物生产3)细胞工程药物生产一、细胞培养的基本条件

实验室条件：环境、设备、器材、试剂

实验操作者工作范畴：无菌操作、温育、培养液配置、洗刷、无菌处理、细胞和用品储存等

实验室条件

无菌环境仪器设备普通器材一般试剂

无菌室结构模式图仪器设备

超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮罐、低温冰箱、重蒸水装置、负压真空泵、普通冰箱、消毒锅、烤箱、水浴锅、天平等

二氧化碳培养箱

back超净工作台

back倒置显微镜back液氮罐back普通器材玻璃瓶皿：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管、抽虑瓶等塑料瓶皿：多孔培养板、培养皿、培养瓶等

培养用品培养瓶（25、75cm3）培养板（96、48、24、12、6孔）培养皿（各种直径规格）培养用品离心管（15、50ml）移液管、吸管冻存管、EP管试剂瓶等。二、细胞培养试剂及其配制一般试剂

水平衡盐液

培养液消化液抗生素液

pH调整液

平衡盐液平衡盐溶液的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH稳定及提供简单的营养平衡盐溶液用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂.使用要在空气中使用,不需要CO2培养箱

HanksD-HanksEarlePBSHBSS

培养液

使用培养液：

天然培养基5-20%

合成培养基80-95%

附加成分再加适量抗生素液，调整pH值即可

细胞培养相关条件细胞培养用试剂培养基a-MEM(minimumEagle’smedium)、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清添加因子生长因子（EGF、bFGF、BFGF）、胰岛素、肝素、二巯基乙醇等抗生素液

链霉素(100ug/ml)

青霉素(100单位/ml)

制霉菌素(100单位/ml)

终浓度不超过万分之一为宜

消化液

胰蛋白酶(0.125-0.25%)

胶原酶(0.1-0.3mg/ml)EDTA(0.01-0.02%)pH调整液5.6%NaHCO2HEPES1NHCL10%HAC1NNaOH

实验前准备

清洗：玻璃、塑料、橡胶、金属类等消毒：无菌室、培养用液、培养器皿（玻璃、塑料、橡胶、金属）等

三、细胞培养的操作步骤清洗示意图白箭头：玻璃制品黑箭头：橡胶制品

消毒：无菌室、培养用液、培养器皿（玻璃、塑料、橡胶、金属）等

消毒方法物理消毒法：射线、紫外线、干热、湿热、过滤、煮沸等 化学消毒法：乳酸、甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭、乙醇等抗生素灭菌细胞来源一.原代培养从机体上取下细胞、组织或器官，让它们在体外维持与生长。（实际中，传10代以内的细胞用作原代培养细胞）特点：表现来源组织或细胞特征。（1）

组织块培养法从机体上取下组织，使其在体外维持与生长，细胞从组织块边缘向外长出，铺满培养瓶（皿），即可进行传代。细胞培养法方法与步骤1)动物处死：将出生2～3d乳鼠，用脱颈方法处死。用酒精棉球擦拭解剖部位。2)取材及剪切：在无菌条件下将组织取出，置于无菌培养皿中，剪去多余的组织（脂肪等），用PBS液洗涤1-2次；放入另一培养皿中，将组织剪成1mm3大小的块。细胞培养法方法与步骤3)消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌试管内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。细胞培养法方法与步骤4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含3～5×105个细胞为宜。5)分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶or培养皿中，盖好，做好标记，置于37℃CO2培养箱中培养。6)观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。细胞培养法注意事项取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中。取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡；传代培养(passageorsubculture)细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养(passage)。细胞的传代培养贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用EDTA溶液与胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合后联合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法注意问题操作全过程注意无菌操作胰酶消化时间要适度吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡贴壁生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期细胞质回缩，胞质呈圆球形10分钟-4小时贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。底物：胶原、玻璃、塑料等细胞株平均在10分钟-4小时贴壁血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期、对数生长期、停止期潜伏期：细胞有生长活动，而无细胞分裂，细胞株潜伏期一般为6-24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期：细胞长满瓶壁，虽有活力但不再分裂，机制为接触抑制、密度依赖性。培养细胞技术----细胞冻存

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。预先配制冻存液：培养基+20%血清+10%DMSO

取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)标记冷冻细胞名称和冷冻日期，加入1ml细胞于冻存管中，立即密封后放入冻存盒，或-20°C冰箱，然后放入-80°C冰箱，最后放入液氮。细胞冻存方法细胞复苏细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1-2分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞形态变化生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。四、细胞培养的常规观察培养液PH值（颜色变化）变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长停滞、死亡。一般生长稳定的细胞需要2-3天换液1次，生长慢的细胞需要3-4天换液一次。细胞培养污染的概念不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此一般包括微生物(真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质(影响细胞生存、非细胞所需的化学成份)及细胞(非同一种的其它细胞)。其中以微生物污染最多见。另外随着细胞种类增多．不同种细胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。污染的途径空气：空气是微生物传播的最主要途径。净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强减少空气流动是防止污染的重要环节。污染的途径器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不彻底CO2温箱．由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而CO2温箱内是开放式培养．如不定期消毒,可形成污染.污染的途径操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不严培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。污染的途径血清：有些血清在生产时就已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。污染对细胞的影响支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养液中后，有的毒性较小、如能及时排出，细胞仍可存活．但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化细菌的污染和检测细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌，以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。细菌污染的检测肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法PCR检测真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，肉眼可见；有的散在生长，倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不发生浑浊。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡真菌污染支原体污染和检测支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2um，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体支原体污染的检测相差显微镜观察法Hayflick培养基直接培养法DNA荧光染色法（Hoechst33258）PCR方法（即用型细胞培养中支原体检测PCR试剂盒）病毒的污染和检测细胞的直接观察动物接种检查电子显微镜观察PCR技术污染的预防防止污染，预防是关键，预防措施应贯穿于整个细胞培养的始终。器皿准备—开始操作前—操作过程中—其他细节方面的预防在培养液中加入适量的抗菌素。常规加入青霉素和链霉素各100U/ml。必要时加入庆大霉素、卡那霉素或两性霉素B等。培养箱内应经常清洁消毒，放置含硫酸铜的消毒水。购入的未灭活血清应采取56℃水浴灭活30min的措施以使血清中的补体和支原体灭活。支原体污染的预防小牛血清是造成支原体初级污染的主要来源次级污染源，即已污染支原体的细胞在污染的传播中更为重要保证培养细胞的来源绝对干净，同时应做好检测，一旦发现支原体污染就应废弃严禁已知污染了支原体的细胞进入未污染的工作区域。严格无菌操作，杜绝人为污染。对每批小牛血清严格检查，灭活、过滤有利于抑制支原体的污染。