用于药物控释的结合对pH敏感的两亲性嵌段聚合物中空介孔二氧化硅纳米粒子

用于药物控释的结合对pH敏感的两亲性嵌段聚合物中空介孔二氧化硅纳米粒子MicroporousandMesoporousMaterials152(2012)16-4XiaoMei,DongyunChen,NajunLi倉,QingfengXu,JianfengGe,HuaLi,JianmeiLu倉LaboratoryofAbsorbentMaterialsandTechniquesforEnvironment,CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandMaterialsScience,SoochowUniversity,Suzhou215123,China1.引言作为一种独特的无机纳米材料，介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)近年来受到关注。由于其优良的生物相容性,可更改的外表面与丰富的颗粒和可调孔隙大小,这些材料已经越来越多地用作生物医学材料，如药物和基因传递、细胞成像、生物传感器等。特别是在最近几年MSNs一直集中应用在药物输送方面。许多研究者们调查了在自然缓释系统的MSNs(比如MCM41和SBA15)。然而，在比较与缓释系统，刺激响应系统可以达到缓释和控释区域选择性，可以提高疗效，减少药物对正常组织的毒性。因此，需采取一些策略来修改外表面并且满足需求的MSNs“零”药物释放药物载体到达目标区域。例如金和同事设计结构的介孔氧化硅粒子被表面接枝聚乙烯亚胺(PEI)/环糊精(CD)，这有可能引发通过可逆取出从毛孔的粒子准聚轮烷释放药物。拜因和同事利用介孔二氧化硅纳米粒子与准备的浇注系统在外面的粒子表面通过延迟co缩合的方法实现药物控制释放。然而，普通的介孔二氧化硅纳米材料有一些缺陷，如低药物装载量、阻塞后的中孔通道吸附的药物分子和不规则形态，它也不是完美的药物载体。为了克服这些缺点，一个独特的介孔硅纳米材料、中空介孔二氧化硅纳米粒子(HMS)已经介绍了他们有一个特殊的结构和空心多孔硅壳。除了MSN的所有的优势外，HMS有其他特征如大的比表面积区和高药物负荷容量。所以许多研究者关注创新的HMS的制备方法。郭和同事准备了HMS与介孔壳穿孔的hexagonally排列的圆柱纳米通道，吴邦国和同事准备了HMS没有额外的溶解和煅烧过程去除聚苯乙烯核,Du和同事准备了HMS使用热敏聚合物作为核心模板等等。然而外表面的修改策略与功能性聚合物控制号药物释放很少报道。根据我们的知识，只有史和同事修改的表面使用叠层HMS(LbL)技术来达到刺激响应性药物控制释放,这系统会触发释放药物不仅在酸环境也在不同氯化钠浓度。为了降低正常细胞的药物的毒性和副作用，药物应该只在癌症细胞中触发释放。当我们知道正常细胞的生理pH值为7.4,而内核体早期和晚期的内核体/溶酶体癌细胞的胞内分别大约是6.0和5.0,所以,pH-reponsitive药物释放可能是一种治疗癌症的有效方法。在此,我们设计了一个改良HMS,HMS@聚合物(PDM-b-PEGMA),它是由嫁接ph敏感diblock两亲性共聚物(聚合物(PDM-b-PEGMA))的外表面通过ATRP的HMS技术。这种策略不仅可以克服不利的低药物装载,但也可以实现药物刺激响应性控释制剂来提高治疗效果。一个更简单的二氧化硅纳米粒子引发剂已经合成了HMS由2-溴代异丁酰溴耦合和3-氨丙基乙氧基硅烷(KH550)合成的。然后2-苯基1、3-烷基-5丙烯酸甲酯(DM)、(乙烯，乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(EGMA)启动。作为合成纳米复合材料的HMS@聚合物(PDM-b-PEGMA)可以负载疏水性药物在空心,壳牌的毛孔和疏水段聚合物壳。在中性水溶液环境中,疏水段收缩表面上和覆盖的毛孔HMS防止释放疏水药物。在弱酸性条件下,疏水段水解为亲水段,导致的变化疏水亲水属性,有利于控制药物释放。2．实验2.1试剂(2-(丙烯酰氧)乙基)氧乙基三甲基氯化铵(AETACwt%在水中,80),2,20-偶氮(2-甲基丙基醚)盐酸盐(V50,>97.0%),溴化十六烷基三甲基铵(溴化十六烷三甲基铵,〉99.0%)。聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA.^=475)。2-溴代异丁酰溴购买从奥尔德里奇溴是购自阿尔法。苯甲醛、丙三醇、酸、三乙胺p亚苄基购买从上海化学试剂有限公司。所有化学品上面有使用前未经纯化。苯乙烯(St,>99.0%)被通过一个抑制剂柱去除对叔丁基邻苯二酚然后在减压蒸馏前使用。原硅酸四乙酯(以正硅酸乙酯)和3氨丙基乙氧基硅烷(KH550)在真空蒸馏和储存在15摄氏度在惰性气体气氛。THF(四氢咲喃)和环己酮是通过减压蒸馏纯化。CuBr在冰醋酸直到无色搅拌,连续用乙醇和乙醚和保持在真空。其他试剂是商用的。合成中孔介孔球形粒子空心介孔球形粒子合成根据文献进行一些修改。准备在聚苯乙烯乳胶模板,1.0克AETAC(80wt%在H2O)是用390.0g水溶解在500ml圆底烧瓶中。然后40.0g的苯乙烯添加到上述溶液中,继续缓慢在800转/分下搅拌30分钟。混合物通氮气20分钟,然后在油浴中加热到90摄氏度。后来,10ml溶液含有1.0gv-50添加到上述溶液中。这个乳液是保持在90摄氏度24h通入氮气来完成聚合的。聚苯乙烯乳胶是在18000转/分用离心15分钟收集然后用乙醇洗数次。获得HMS后,0.8g的溴化十六烷三甲基铵溶解在一个混合的29.0g水,12.0g乙醇和1.0ml氢氧化铵溶液中。930mg的PS粉通过声波降解法分散在10.0g水,然后一滴一滴地添加到溴化十六烷三甲基铵溶液中并在室温下剧烈搅拌,超声波降解10分钟。生成的乳白色的混合物搅拌30分钟前添加4.0gTEOS。混合物在室温下搅拌48h这个混合物是介孔硅涂布胶乳是通过在7000rpm离心40分钟得到的。用大量乙醇洗涤，然后在室温下干燥。最后，材料是在600摄氏度的空气中煅烧在8h在加热速度3oC/分钟下。2.3修改ATRP引发剂表面的粒子HMS几百微升的KH-550被添加到HMS甲苯(50mL)溶液中搅拌24h。由此产生的胺化了的纳米粒子是由离心收获7000rpm,用乙醇洗好几次，然后分散在无水四氢咲喃(30ml)中通过声波降解法。三乙胺(1摩尔等价物)添加到上述溶液中并冷却到0摄氏度在冰浴中。一个轻微的过剩(1.2mol当量)的2-溴代异丁酰溴一滴一滴地溶解在四氢咲喃(10ml)中。在室温下搅拌48小时,混合物是溶解在水中,粒子的分离纯化分别用四氢呋喃、丙酮和乙醇洗涤三次然后在真空中干燥。2.4HMS@poly(PDM-b-PEGMA)的合成我们以前报道的，PDM是由单体甲基丙烯酰氯的反应用甘油和氯化苯甲醛。HMS-Br(100mg),PDM(2.48g,10mmol),环己酮(2毫升)在搅拌条件下被添加到聚合管中。超声降解法约10分钟，将CuBr(115.2mg08mol),PMEDTA(277.3mg,1.6mmol添加到这个溶液中。管是密封的在真空和氮气之间循环三遍。6小时后在90摄氏度下让纳米复合材料在乙醚中沉淀,可以创造出一个绿色的原油产品(HMS@poly(PDM))。HMS@poly(PDM)(200mg),PEGMA(3.8g,8mmol)和甲苯(4ml)添加到溶液中混合和用超声降解法分散约10分钟,然后将CuBr(115.2mg。0.8mmol)和PMEDTA(277.3mg,1.6mmol)添加到这个溶液中。管是密封的在真空和氮气三次然后在90摄氏度约24h。纳米复合材料是通过降水的孤立从乙醚,其次是过滤,然后用乙醇洗,离心分离机和干燥,可以制造出一个绿色的原油产品(HMS@poly(PDMb-PEGMA))。2.5．去除铜污染物因为铜残留在纳米复合材料原油产品是绿色的颜色。从纳米复合材料中去除铜污染物,原油产品浸泡在乙酰丙酮/乙醇溶液(100毫升，体积比为1:5)中24h。然后产品通过离心分离和用乙醇和多余的水洗涤几次。通过这种方式,白色产品几乎获得。2.6封装和释放模型药物(尼罗红)评估药物装载和释放特性,一个染料尼罗河红色被用作模型代理。尼罗红丙酮溶液(20我,1毫米)添加0.4ml的一滴一滴地上述纳米复合材料在四氢咲喃溶液(5mg/mL)中，其次是缓慢滴加10ml的磷酸缓冲（10、中和后的pH=7.4）溶液。这个四氢咲喃、丙酮被蒸发完全通过摇晃在一夜之间。药物释放试验是由暂停纳米复合材料在磷酸缓冲盐（PBS）缓冲区（pH=7.4）在37C水浴来维持一个恒定的温度。确定释放量在任何鉴于pH值，得到的胶体被分为三个等效零件和通过醋酸缓冲来适应不同的pH值。药物浓度分析是通过荧光强度来测量的。2.7封装和释放抗癌药物阿霉素（阿霉素）评估药物负荷容量和释放性能，阿霉素（阿霉素）作为模型抗癌剂。在此前的报告中我们使用三乙胺从盐酸阿霉素阿霉素（DOXHC1提取水不溶性的自由。加载到作为准备免费阿霉素纳米复合材料，三个不同比例的纳米复合材料分别分散在lmlPBS缓冲溶液（4、2和0.4mg/ml）和然后阿霉素溶液（5mg/mL1）加震动24小时。理论药物装载内容（wt%）（饲料比例）分别为5%，10%和50%。那么药物装载纳米复合材料是由离心分离得到的。剩余的阿霉素浓度由荧光分光光度计测量的分别为kex=480nm和kem=627nm。一个标准的结构在相同的条件下准备确认数量的药物加载的纳米复合材料。药物装载内容和药物装载效率的阿霉素的计算方式如下。药物装载内容（wt:%）：（装载的重量/纳米材料的重量）*100%药物装载效率（%）：（药物装载重量/药物的重量）*100%体外实验细胞培养和准备人类肝癌7402细胞线和发烧度肺癌细胞系（购自上海细胞库细胞研究所国家，中国）作为一个单层培养在rpmi-1640中，有10%的热灭活胎牛血清在37摄氏度在一个湿孵化器（5%的二氧化碳在空气中,v/V）。体外细胞培养这个aminoxanthene染料，蛋白标记B（SRB），是用来作为一个试验在不同浓度来评估药物载体的影响。总之，增长7402细胞和肝癌发烧度肺癌细胞被放置在96孔板（1.3104个细胞）和四个重复设置在每个样本。培养基被替换为介质包含不同浓度的药物载体（0、0.390625、0.78125，1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、500）和培养。lgmL1在37摄氏度在湿孵化器中引入（5%的二氧化碳在空气中,v/v）的细胞固定在盘子里。培养24小时后，将介质倒去,添加10%（w/v）的三氯乙酸在溶液（1001L）中并储存在4摄氏度下1h。然后被丢弃的固定液,细胞用去离子水洗涤5次，然后风干，在0.4%（w/v）SRB溶液中（1001L每井）在室温下储存30分钟。将SRB去除后，这些细胞被0.1%醋酸溶液洗涤5次。绑定SRB染料是可溶性与10中和L1三基地的解决方案（150lL,pH=10.5）。光学密度（OD）值计算每个个体的良好使用分光光度计在531nm吸光度。细胞素的吸收细胞和肝癌7402细胞发烧度被播种在96-好板（1.3104细胞/好）并孵化在37摄氏度在湿孵化器中。国内外纳米复合材料的分散性准备在rpmi-1640中描述以上和浓度的药物装载10毫克mL1中引入。细胞培养与上述溶液在一定时间使用荧光显微镜，观察后用PBS洗了三次。被收购的荧光图像使用奥林巴斯ix51倒置显微镜配备100w汞-氙弧灯激发光源和高速CCD相机。表征红外光谱测量是表现在尼科莱牌手表KBr丸4700光谱仪（热费舍尔科学）在范围400-4000cm1。1hNMR光谱测量一个爱诺瓦牌手表400MHz的核磁共振仪器。制备了核磁共振的样品分散12mg产品在0.5mlDMSO-d6。TEM图像通过使用一个TecnaiG220获得电子显微镜在加速电压200伏特下得到。样品的制备通过TEM观察将一滴分散的纳米粒子对铜网格。SEM照片拍摄在日立s-4700装备与一个能量色散x-射线谱(EDS)。室温发射和激发光谱进行使用爱丁堡-920荧光分光光度计。热重分析(TGA)被记录在一个sta-449c热分析仪在10摄氏度mini在N2气氛。(打赌)和巴雷特,Joyner,Halenda(BJH)分析被用来确定表面积、孔隙大小、孔隙体积和获得与QuantachromeAutosorb1c装置在196oC在连续吸附条件。3.结果和讨论HMS-diblock聚合物的合成方案2显示了准备HMS@poly(PDM-b-PEGMA)纳米复合材料的原理程序。单分散的HMS首先由KH550胺化。由此产生的胺化了的纳米颗粒是用溴化反应2-溴代异丁酰溴获得ATRP引发剂。介绍了用傅立叶变换红外光谱确认是否已经成功地制备。而用傅立叶变换红外光谱纯HMS(图1)的新巅峰HMSbr观察大约1660和1550cmicmi,由于拉伸m(c=o)振动模式和弯曲d(NH)振动模式,表明硅氧烷引发剂是成功的附着到HMS上。然后疏水单体PDM和亲水性单体通过ATRP的方法从表面嫁接PEGMA得到的二氧化硅球。与@C吸收带相关的-H(700年和770年cm1cm1)和骨架振动(1500cm1)的苯环,coc(1150cm1)和C@O(1740cm1)观察，进一步证实了聚合物已成功的从HMS嫁接上。为了进一步确认diblock结构的共聚物,1hNMR、EDS和TGA是否被引入。根据1hnmr(图2)谱的HMS@poly(PDM),信号的甲川这代表了缩醛呈现在d=4.5(b)和5.5(d)ppm意味着PDM是成功接枝从表面的通过ATRP方法。相比HMS@poly的光谱(PDM)，新的化学变化在d=3.51(e)和3.24(f)ppm归因于PEGMA出现在HMS@poly的光谱(PDM-b-PEGMA)。这些结果表明,diblock共聚物它包含一个PDM块和一块PEGMA成功的合成了通过ATRP方法。见图3,纯HMS的Si和O元素(图3a-1)被观察到。碳的特征峰的可能造成被污染的油和其他有机化合物在空气中。修改后由硅氧烷启动程序，通过Br一个新的峰分配成功表示。图3a-3显示了EDSHMS@poly光谱(PDM)。当与图3一2,C元素的内容增加了很多而相对数量的硅元素减少，确认完成第一步聚合。此外，Br的峰代表现有的“活的”终端官能团。通过ATRP方法修改后的PEGMA,浓度进一步降低,Si相对数量的C增加(图3一4),证明第二个块的聚合物从HMS@poly(PDM)接枝上。TGA(图3b)是用来表征成功合成的聚合物HMS@poly(PDM-b-PEGMA)。众所周知，硅材料可以忍受高温度和所有的重量损失应该是由于有机化合物,纯HMS几乎没有重量损失。在用引发剂改性后，大分子引发剂失去的重量有10wt%。此外，通过ATRP方法改性后的PDM,重量损失30%在200和350摄氏度之间可以清楚地观察到，表明重量的聚(PDM)大约20wt%°HMS@poly(PDM-b-PEGMA)的重量损失增加到75wt%，表明约45wt%的PEGMA已经成功接枝到HMSPDM纳米复合材料上。所有这些结果证明HMS@poly(PDM-b-PEGMA)成功地制备。为纳米复合材料的性能作表征为了调查HMS@poly(PDM-b-PEGMA)的形态，获得的纳米复合材料进行了SEM和TEM表征。如图4所示,有一个单分散纳米核心-壳结构和空心和介孔硅聚合物壳。从图4a,b和e,我们可以发现，纯HMS是统一的和单分散与粒径约180nm有多孔壳约35nm。多孔的结构尺寸很适合药物输送。图4c和d显示修改后HMS共聚物通过ATRP方法的宏观结构°TEM显微图清楚地表明,外表面HMS的成功通过聚合物薄膜包装，原通道模糊，证实渠道受阻。这个形态学的HMS嫁接与聚合物通过ATRP是观察利用扫描电子显微镜(图。4f)。相较纯粹的HMS(图。4e)，表面HMS是平滑的，建议的外层表面,HMS共轭聚合物成功和几乎所有的表面被覆盖。此外,纳米复合材料仍保持均匀的粒度和高质量的单分散性是非常重要的药物载体。破碎的纳米复合材料显示插图进一步确认空心仍然保持在结构和聚合反应只发生在HMS的表面。因此，药物分子可以保持在里面通过阻断的HMS的聚合物。为了进一步证明通过聚合物纳米复合材料的的空心和多孔壳覆盖,用吸附分支的氮等温线的BJH(Barrett-Joyner-Halenda)介绍。图5显示了N2吸附解吸等温线的HMS纳米粒子和相应的孔隙大小分布曲线。纯HMS的比表面积可以达到548m2/g计算的线性部分的BET(Brunauer-EmmettTeller)情节和窄孔隙大小分布在3nm处达到顶峰(图5)。修改后的HMS、比表面积和孔隙大小分布的HMS几乎没有变化，证实了有孔隙结构。空心核心和多孔壳修改后仍在保留(图5b)。共轭聚合物的比表面积和孔径变小也许归因于块聚合物的通道(图5c),不过这并不妨碍药物装载。从图5d,N2吸附解吸等温线HMS-polymer@DOX是最低的，表明这些药物加载成功。因此，作为制备好的纳米复合材料显示出良好的稳定性，可以作为药物载体。封装和在体外释放尼罗河红为了测试药物在体外释放能力的纳米复合材料,尼罗红被用作模型抗癌剂。获得的样品装载药物分子被分成三个部分，由磷酸缓冲溶液与调整不同的pH值(pH值为4.6、5.6和7.4)。尼罗红的释放测量了荧光和统计图表的荧光强度在图6中显示。尼罗河红通过HMS@poly(PDM-b-PEGMA)被载入因其优异特性的荧光。一旦尼罗红释放将分离出的缓冲溶液，使其荧光强度降低。在温和的酸性条件下(pH值5.6和4.6)，荧光强度减少了近70%和80%在6h,证实该药物在酸性条件下被释放。相比之下，荧光强度几乎没有变化，说明药物不能在正常生理条件下释放。本研究证实,ph响应性纳米复合材料可以应用对于疏水性药物释放的触发。为了进一步探讨药物释放性能，我们模拟释放过程。图6b显示了不溶于水的尼罗河红可以在中性水介质纳米复合材料(pH=7.4)成一个均匀的状态。在被调整为酸性条件(pH=5.6),加载的尼罗河红将释放和沉积在底部的小瓶，见图6c清楚。我们知道,正常的细胞显示中性特点和大多数肿瘤细胞是弱酸性的，所以上面的结果可以告诉我们制备的HMS@poly(PDM-b-PEGMA)可能是一个潜在的药物载体将释放药物只有在癌症细胞。这个细胞实验将在下面讨论说明可能应用体外。评价阿霉素加载和释放评估药物装载量、强力霉素作为一种抗癌药被广泛适用。理论药物装载内容被设定在5%，10%和50%。阿霉素装载效率分别为88%，82%和74%(表1)，纳米复合材料能够实现高药物加载内容阿霉素，远远高于一般的微胶粒和固体纳米粒子。高存储容量可能是主要原因存在的空心核中，药物分子可以被存储。介孔材料相比，药物分子将阻止该中孔通道在被吸附和减少孔隙体积。此外，这些纳米复合材料可以储存药物分子在渠道和疏水性聚合物壳，进一步提高药物负荷容量。阿霉素的体外释放进行了研究在低药物装载内容(ca。5重量％)，是显示在图7。在中性条件(pH=7.4),不到10wt%阿霉素内释放100小时，几乎是“零”释放。而在弱酸性环境，阿霉素分别约55重量%(pH=5.6)和65wt%(pH=4.6)是10小时内