茶树蛋白质提取纯化及双向电泳的研究

茶树蛋白质提取纯化及双向电泳的研究

功能诱导组研究的繁荣促进了蛋白质组学作为后基因组时代的研究内容之一。双向凝胶电泳技术是蛋白质组研究的三大关键核心技术之首1材料和方法1.1材料表面取自福建农林大学教学试验茶场的毛蟹品种,一芽二叶,液氮固样,贮存于-80℃冰箱备用。1.2蛋白质提取与生化方法1:样品用液氮研磨,过滤后,按文献[14],即人体细胞蛋白质双向电泳方法进行。方法2:按文献[12],即水稻蛋白质双向电泳分析新方法进行。方法3:按文献[11],即荔枝蛋白质双向电泳的改良方法进行。方法4(改良方法):蛋白质丙酮干粉制备:研钵用适量的液氮预冷后,加入0.4g的水不溶性PVP(Waterinsolublepolyvinylpyrrolidone),0.1gDTT(dithiothreitol)和茶叶样品2.0~2.5g,在液氮中研磨成粉末,转入10ml离心管,悬浮于8倍体积的-20℃预冷丙酮[含质量分数为10%TCA(trichloroaceticacid)和体积分数为0.07%β-Me(β-Mercaptoethanol)]。涡旋振荡后于-20℃静置1h,4℃,15000g离心15min。弃上清液,取沉淀,加入6倍体积的-20℃预冷丙酮(含0.07%β-Me),涡旋后于-20℃静置2~3h。同上离心,弃上清,取沉淀,重复两次。最后取沉淀,用封口膜封住管口,于-20℃放置3h,挥发去丙酮,真空干燥,在未充分干燥前,不断搅拌蛋白沉淀,以免结快,使之成粉末状,即成蛋白质丙酮干粉,置于-20℃保存备用。蛋白质提取:称取蛋白质丙酮干粉40mg,以1:20(mg/ìl)加入样品裂解液[9.5mol/Lurea,2.0%(V/V)NP-40(NonidetP-40),0.5%(V/V)两性电解质载体(AmpholinepH4-7,pH6-9,pH3.5-10比例为2:1:1),5mmol/Lβ-Me(β-Mercaptoethanol)]。涡旋振荡后于37℃水浴2h。4℃,15000g,离心15min,取上清,按1:4(v/v)加入-20℃预冷丙酮(含5mmol/Lβ-Me)于室温下沉淀蛋白2h,同上离心,弃上清,加入适量的上述样品裂解液复溶,37℃水浴2h,取少量上清用BCA法测定总蛋白的浓度固相pH梯度双向电泳:第一向固相pH梯度等点聚焦(IEF电泳):总蛋白质提取物(1000μg)与水化液[8mol/Lurea,0.5%TritonX-100,4.0%CHAPS(3-[(3-cholamidopeopyl)dimethylammonio]-1-tropanesulfonicacid),18mmol/LDTT,0.5%IPG(ImmobilizedpHgradients)缓冲液pH3-10L,痕量溴酚蓝]充分混合,总体积350ìl,15000g离心30s,取上清,加入IPGstrip持胶槽,将IPG干胶条pH3-10L(180mm×3mm×0.5mm)去保护膜,胶面朝下,小心放入持胶槽,尖端在阳极,平端在阴极。赶净气泡,用IPG覆盖液封闭,防止样品液蒸发,盖好持胶槽盖子后置于IPGphor水平电泳仪(AmershamPharmaciaBiotech)电极板上,水化和等点聚焦在20℃条件下自动进行。总电压为40kVh,其中水化在30V,进行16h,然后500V,1h;1000V,1h,最后稳定在8000V下进行。第二向SDS垂直电泳:等电聚焦后,迅速取出IPG胶条,分别于40ml平衡液A[1.5mol/LTris-HCl(pH6-8),6mol/Lurea,30%甘油,2%SDS(sodiumdodecylsulfate),0.2%DTT]和40ml平衡液B[1.5mol/LTris-HCl(pH6-8),6mol/Lurea,30%甘油,2%SDS,3%碘乙酰胺,痕量溴酚蓝]中各平衡15min。将IPG胶条移至200mm×200mm×1.5mm,13%的均匀胶上方,排净气泡,用0.5%琼脂糖(用电泳缓冲液Tris-Gly-SDS配制)封闭。12℃循环水冷却,20mA恒流电泳,直至溴酚蓝到达胶底边时停止电泳。染色:凝胶染色采用考马斯亮兰第二向SDS电泳完毕,首先将凝胶用考马斯亮兰染色液(0.3%考马斯亮兰R250,50%甲醇,10%冰醋酸;39.7%H考马斯亮兰脱色后,用重蒸水淋洗10min,然后敏化液(400ml乙醇,20ml37%甲醛,2ml50%戊二醛,重蒸水定容至1000ml)处理5min,接着40%乙醇处理20min后,用0.6mmol/LNa蛋白质分子量和等电点采用二维校正法(ID-Calibralion)确定。干胶制备:参考陈伟方法进行2茶树芽叶蛋白质的分离纯化方法1(参照人体细胞的蛋白质提取和双向电泳方法),茶树芽叶蛋白质的提取得率仅为5.2mg/gFW(图1a),绝大部分蛋白质已丢失。得到茶树芽叶双向电泳二维图谱如图2a所示,蛋白质斑点较少,蛋白质提取物含杂质太多,对横向和竖向干扰太大,蛋白质斑点不能呈圆形或椭圆形。方法2(参照水稻的蛋白质提取和双向电泳方法),茶树芽叶蛋白质的提取得率仅为10.3mg/gFW(图1b),已丢失大量蛋白质。得到茶树芽叶双向电泳二维图谱如图2b所示,蛋白质斑点最少,蛋白质组分不能有效地分离,且不能均匀地分布在电泳凝胶上。方法3(参照荔枝的蛋白质提取和双向电泳方法),茶树芽叶蛋白质的提取得率有所提高,为25.5mg/gFW(图1c),双向电泳二维图谱如图2c所示,分布均匀程度有所改善,但是仍有许多蛋白质组分未能有效分离,且横向和竖向干扰较大。方法4,茶树芽叶蛋白质的提取得率高达33.7mg/gFW(图1d),在双向电泳二维图谱(图2d)上,蛋白质组分得到有效分离,斑点可达500多个,且比较均匀地分布在凝胶上,蛋白质样品的杂质大大减少,大多数蛋白质斑点呈圆形或椭圆形,清晰可见,分离出的各蛋白质组分基本上没有拖尾、纹理和横向扩散。本试验结果表明,茶树芽叶蛋白质的相对分子量约在14.0kD~100.0kD范围内,主要分布在14.0kD~67.0kD之间。等电点约在4~9.5范围内,主要分布在4~6.5。3蛋白质应用程序改良方法实验表明,方法1,方法2,方法3,皆未能适合茶树材料。方法4即改进后的蛋白质提取和双向电泳方法能适用于茶树蛋白质组研究。笔者将此方法应用于茶树外源诱导的蛋白质组分析,结果表明,该方法具有很好的重复性和稳定性,并分离出5个特异蛋白质组分。该改良方法是针对茶树材料特性,综合了前人的研究结果,并进行了如下技术改进:(1)蛋白质提取:用液氮研磨,同时加入PVP和DTT,并用预冷丙酮[含0.07%(V/V)β-Me]反复沉淀数次,直至色素完全去除干净;样品与丙酮的比例(V/V)由1:4提高到1:6~8。(2)IEF电泳:蛋白质的裂解与水化分别吸取了方法1和方法3的优点,用方法3的裂解液,用方法1的水化液,并将二者有机结合。同时,裂解液的两性电解质载体增加了两种pH范围(pH4~7,pH6~9),它们的总量在裂解液中比例由2.5%降低至0.5%;水化液中添加0.5%的TritonX-100。(3)SDS电泳:提高平衡液总量,使凝胶与平衡液体积比由1:10提高到1:20。(4)染色:将单一的染色方法改为考马斯亮兰染色和银染相结合,并对银染方法稍作改进,缩短时间,提高银染效果。本研究发现一种辨别茶树蛋白质样品质量好坏的简便方法。含茶树芽叶蛋白质样品的裂解液与水化液充分混合后,若出现浑浊现象(即使浑浊在若干分钟后有可能会自动消失),说明蛋白质样品含有杂质,势必干扰双向电泳,须重新制备样品。两性电解质载体(Ampholine)是等电聚焦的关键试剂实验表明,该改良方法适用于茶树的蛋白质组研究。但存在一个普遍性问题:方法1可分离出人体细胞蛋白质斑点1200个左右,方法2可分离出水稻蛋白质斑点700个左右,