高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中12种多环芳烃

高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中12种多环芳烃

多环芳烃（pahs）是指未完全燃烧的碳氢化合物，如煤炭、石油、木材和烟草。环境和食物的污染物。研究表明，PAHs具有致癌、致畸及致突变性，它可以通过呼吸道、消化道以及皮肤进入人体，然后经肝脏氧化酶代谢生成羟基多环芳烃(OH-PAHs)，最后随尿液排出体外目前检测OH-PAHs的方法主要有:高效液相色谱法但这些方法色谱分析时间长达20min，不适用于大批量人群的OH-PAHs检测，而且灵敏度不高(最低检出限为0.01ng/mL)，不能准确定量非暴露人群的OH-PAHs。本研究使用高灵敏的ABSCIEXQ-TRAP5500液相色谱质谱联用仪，通过优化色谱条件(增加流速、进样量和梯度洗脱时有机相比例的增速)以及前处理方法(增加样品前处理浓缩倍数)，建立了同时测定人尿中12种多环芳烃(萘、芴、菲、芘、1材料和方法1.1全自动固相萃取法液相色谱串联质谱:Q-TRAP5500(ABSCIEX);全自动固相萃取仪:PrevalSPE304+(普立泰科仪器);低速离心机(北京金立);氮吹仪(安普公司);GH型隔水培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司);BondElutC1.2羟基3-羟基OH-PAHs标准品:2-羟基萘(纯度99.9%)、1-羟基萘(纯度99.8%)和1-羟基芘(纯度99.8%)购自德国Dr.EhrenstorferGmbH公司，3-羟基芴(纯度99.70%)、2-羟基芴(纯度98%)、2-羟基菲(纯度95%)、1-羟基菲(纯度98%)、3-羟基内标:3-羟基菲甲醇:HPLC试剂(德国VWR公司);冰醋酸、乙酸、乙酸铵:分析纯(南京化学试剂一厂);β-葡萄糖苷酸酶(25mL,Sigma-Aldrich公司);实验纯水(娃哈哈纯净水);人工尿液(东莞市信恒科技有限公司)。1.3标准贮备溶液标准溶液配制:准确称取12种OH-PAHs标准品，溶于甲醇，配成约1.0mg/mL的标准贮备溶液，于-4℃避光保存。内标溶液配制:准确称取2种内标贮备液适量，溶于甲醇，配成约1.0mg/mL的标准贮备溶液，再用甲醇稀释成浓度为50.0μg/mL的内标中间液，于-4℃避光保存。1.4样品处理方法1.4.1酶分解1.5离子多反应监测色谱柱:WATERSACQUITYue5f8BEHC离子化方式:电喷雾(ESI)离子源;负离子多反应监测(MRM)扫描;气帘气(CUR):40275.8;碰撞气(CAD):Medium;喷雾电压(IS):-4N500V;去溶剂温度(TEM):550℃;雾化气(GS1):65448.2;加热气(GS2):65448.2;保留时间、离子对、碰撞电压和去簇电压见表2。2结果2.1人工历史上的oh-pahs浓度准确吸取12种OH-PAHs混合标准液适量(混合标准液1、10、100ng/mL各吸取25、50、100μL,1mg/mL吸取25、50μL)以及100μL浓度为50ng/mL的内标溶液，加入10mL空白尿液(人工尿液)中，配制成尿样中OH-PAHs浓度分别为0.0025、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5ng/mL的尿样样品(内标物浓度为0.5ng/mL)，样品经前处理后浓缩20倍(10mL尿液浓缩成0.5mL)，浓缩成浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100ng/mL的工作曲线(内标物浓度为10ng/mL)进行UPLC-MS/MS分析。以被测组分的峰面积A和内标物的峰面积As之比A/As(y)对相应的质量浓度(x,ng/mL)做校准曲线，其中2-羟基萘、1-羟基萘、3-羟基芴、2-羟基芴、2-羟基菲、1-羟基菲以3-羟基菲2.2回收率及精密度准确吸取12种OH-PAHs混合标准溶液适量添加在10.0mL空白尿样中，配制成尿样浓度分别为0.04、0.40和2.00ng/mL的加标样品，经前处理后进行UPLC-MS/MS分析，每个浓度做6个平行样品，进行加标回收率和精密度实验(表4)。结果表明，这12种OH-PAHs在3个不同浓度下回收率为90.8%～104.0%，方法重复性RSD均<10%。3讨论3.1条件1本实验选用了WatersSymmetryC3.2固相萃取和柱的选择选取了AgilentBondElutC3.3洗脱溶剂选择选取5mL0.05%氨水乙腈、0.05%氨水甲醇、乙腈、甲醇作为洗脱溶剂，结果表明0.05%氨水甲醇的洗脱效果和0.05%氨水乙腈接近，高于其他2种洗脱溶剂(图4)，甲醇比乙腈更容易被吹干，故选用0.05%氨水甲醇为洗脱溶剂。选取了4,5和6mL0.05%氨水甲醇的洗脱效果，5和6mL的洗脱效果相似，高于4mL。为了节省氮吹时间，选用5mL0.05%氨水甲醇洗脱。3.4方法限制本实验采用仪器3倍信噪比为仪器检出限，再根据样品经前处理后浓缩20倍，计算出各化合物的方法检出限。与付慧等3.5加标回收样的回收率羟基多环芳烃属于光敏性物质，实验过程中应注意避光。每批样品检测时应附带标准溶液、空白尿样和低、中和高3种浓度加标回收样，以保证方法的准确性。各化合物保留时间的偏差应在1.5%以内，加标回收样的回收率应在80%～120%之间。应用本方法测定了南京市某地区的200份人尿样品，12种化合物均有检出，其中3-羟基苯并[a]芘的检出率最低，1-羟基芘的检出率最高，各化合物的检出率和检出浓度范围见表5。4尿样的检测本试验建立了同时测定人尿样中12种多环芳烃(萘、芴、菲、芘、利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突移取10.0mL人尿样于50mL离心管中，加入100μL浓度为50ng/mL的内标溶液，此时尿样中内标浓度为0.5ng/mL