内酰胺类抗生素高分子杂质测定法

第一节β-内酰胺类抗生素中高分子杂质一、定义β-内酰胺类抗生素（β-lactamantibiotics）系指化学结构中含有β-内酰胺环一大类抗生素，包含临床最惯用青霉素（penicillins）与头孢菌素（cephalosporin），以及近年开发头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其它非经典β-内酰胺类抗生素。

系对药品中分子量大于药品本身杂质总称。其分子量普通在1000～5000，个别可至约10000道尔顿，小于化工、生化领域中所指高分子化合物分子量。

8/29/20231内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第1页β-内酰胺类抗生素中高分子杂质二、分类及起源按其起源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。外源性杂质：包含蛋白、多肽、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等结合物。普通起源于发酵工艺，如青霉素中青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。8/29/20232内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第2页内源性杂质：抗菌药品本身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时使用不妥也可产生。抗生素聚合物免疫原性通常较弱，但作为多价半抗原，可引发速发型过敏反应。

免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞能力。抗原性(antigenicity)：抗原与其诱生抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合能力。也写作反应原性。

完全抗原：同时具备2个性质。天然蛋白质都是完全抗原。半抗原(hapten)：只有抗原性而没有免疫原性物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生物质，称为半抗原。普通分子量较小，如化学药品。半抗原+载体(carrier)→完全抗原

。

速发型过敏反应是一个常见过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。伴随当代生产工艺不停改进和提升，当前产品中外源性杂质日趋降低，对内源性聚合物控制是当前抗生素药品高分子杂质控制重点。8/29/20233内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第3页图1水温引发阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量改变8/29/20234内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第4页β-内酰胺类抗生素中高分子杂质三、形成机理及结构特征（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两大类。8/29/20235内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第5页青霉噻唑多肽：制剂中青霉噻唑多肽分子量主要分布在3500～2400道尔顿左右，有青霉素β-内酰胺环和多肽伯氨基按亲核反应机理缩合而成，主要发生在发酵工艺中。样品在储存过程中，多肽类杂质残留自由氨基仍与β-内酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本身水分含量及储存温度相关。8/29/20236内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第6页青霉噻唑蛋白基本结构青霉素G内酰胺环断裂点8/29/20237内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第7页青霉素聚合物：1.反应仅和母核结构相关，侧链中活性基团不参加反应。一分子青霉素首先开环，形成一新活性位点，并与另一分子青霉素聚合。2.侧链参加聚合反应主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上氨基亲核攻击β-内酰胺抗生素羰基碳原子，形成聚合物。8/29/20238内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第8页头孢菌素：头孢菌素中高分子杂质主要是不一样类型聚合物。1.只与母核结构相关N型聚合反应eg.头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等2.侧链参加L型聚合反应。eg.头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等在碱性条件下，两种反应都能够发生。8/29/20239内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第9页β-内酰胺类抗生素中高分子杂质四、结构特点高度不均一性和不确定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质发酵中产生任何蛋白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同蛋白或蛋白碎片上能够结合不一样数目标药品分子。8/29/202310内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第10页2.聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不但能形成聚合度不一样聚合物，许多样品还能同时发生不一样机理聚合反应。3.形成聚合物可发生不一样程度分（降）解反应，如开环等。4.对以异构体形式存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。5.实践中发觉高分子杂质种类及数量和生产工艺亲密相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷雾干燥法高分子杂质含有不一样特异性，且二者聚合物含量显著不一样。冻干粉二聚物溶媒粉二聚物8/29/202311内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第11页β-内酰胺类抗生素中高分子杂质五、影响聚合物形成原因1.青霉素聚合物青霉素聚合反应速度在溶液条件下和溶液酸碱度关系亲密；在固体条件下主要和样品水分含量相关。

8/29/202312内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第12页2.头孢菌素聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度关系亲密。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至37℃时，含水量差异对聚合物含量影响十分显著。8/29/202313内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第13页β-内酰胺类抗生素中高分子杂质六、口服青霉素类药品使用前进行皮试必要性口服青霉素类抗生素在国内外都有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报道，在青霉素V聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。所以，在口服青霉素类抗生素前，必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要。8/29/202314内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第14页β-内酰胺类抗生素中高分子杂质七、抗生素高分子杂质质控意义1.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质是引发临床速发型过敏反应过敏原；2.高分子杂质经注射和口服都可引发过敏反应，所以注射剂和口服剂都应控制。3.高分子杂质是β-内酰胺类抗生素质量评价主要指标，可评价药品质量和稳定性，并可借此深入评价其生产工艺。8/29/202315内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第15页第二节高分子杂质分析方法高分子杂质质控方法化学分析免疫学分析色谱法分光法（P值法）间接血凝法豚鼠PCA法反相模式离子交换模式凝胶色谱模式一、概述8/29/202316内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第16页因为结构不一样高分子杂质通常有相同生物学特征，如：均为过敏性杂质，所以，在药品质量控制中普通不需分别控制不一样结构高分子杂质含量，而只需控制药品中高分子杂质总量。故依据分子量差异进行分离凝胶色谱模式是简便易行分离模式。以葡聚糖凝胶SephadexG-10为基础凝胶色谱分析方法，可简便地用于对各种β-内酰胺类抗生素中高分子杂质分离、分析，并满足药品质量控制需要。8/29/202317内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第17页高分子杂质分析方法二、凝胶色谱系统分离原理及特点

8/29/202318内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第18页凝胶色谱系统分离原理及特点1.凝胶色谱法凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来一个快速而又简单分离分析技术，因为设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高分离效果。它是利用一些凝胶对混合物各组分因分子量不一样，其阻滞作用也不一样而进行分离、分析方法。

8/29/202319内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第19页凝胶色谱系统分离原理及特点2.凝胶色谱系统分离原理（1）利用凝胶色谱分子筛机制，但凝胶孔径要比分子筛大得多，普通为几百至几千埃。让药品分子自由进入凝胶颗粒内部，而全部高分子杂质被排阻，进而实现让全部高分子杂质含有相同保留时间构想。8/29/202320内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第20页凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图8/29/202321内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第21页凝胶过滤柱层析所用基质是含有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒物质。这种物质能够完全或部分排阻一些大分子化合物于筛孔之外，而对一些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一个被分离化合物被凝胶筛孔排阻程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中百分比关系）表示。

8/29/202322内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第22页试验证实，SephadexG-10凝胶可基本确保全部β-内酰胺抗生素中高分子杂质被排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系数；Ve：被分离物质洗脱体积；Vo：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有体积（外水体积）；Vt：柱内凝胶颗粒占有体积与外水体积之和（柱床体积）

普通Kav≈0洗脱组分视作高分子杂质。8/29/202323内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第23页外水体积（Vo）

：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间体积，即液体流动相体积；内水体积（Vi）

：凝胶颗粒中孔穴体积，即固定相体积；基质体积（Vg）

：凝胶颗粒实际骨架体积。Vt=Vo+Vi+Vg柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳总体积8/29/202324内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第24页洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液体积。普通是介于Vo和Vt之间。（1）对于完全排阻大分子，因为其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故Ve=

Vo；（2）对于完全渗透小分子，因为能够存在于凝胶柱整个体积内，故Ve=

Vt；分子量介于二者之间分子，其洗脱体积也介于二者之间，但，有时也出现Ve＞

Vt，这是因为这种分子与凝胶吸附作用造成。8/29/202325内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第25页凝胶层析洗脱示意图（1）完全排阻大分子（2）中等分子（3）完全渗透小分子（4）吸附分子8/29/202326内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第26页通常选取蓝色葡聚糖作为测定外水体积物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采取肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。不过，在测定激酶等蛋白质分子量时，不宜用蓝色葡聚糖测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。8/29/202327内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第27页Vo测定8/29/202328内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第28页Vt测定8/29/202329内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第29页（2）因为溶质分子和凝胶介质间存在各种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质表面。（3）在凝胶颗粒内部含有较大比表面积和较小自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，所以溶质分子在凝胶颗粒内部较凝胶颗粒外部更易被吸附。（4）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对药品分子吸附作用大于对高分子杂质吸附作用。8/29/202330内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第30页有目标利用药品分子和凝胶间次级相互作用，使药品分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改进高分子杂质和药品分子之间分离度。（5）在深入研究药品和葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该相互作用影响基础，经过调整色谱过程中流动相组成、浓度、pH和流速等参数，调整药品分子和凝胶颗粒间相互作用，进而调整高分子杂质和药品分子间分离度。8/29/202331内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第31页凝胶色谱系统分离原理及特点3.

SephadexG-10凝胶色谱法分离β-内酰胺抗生素中高分子杂质概况：在SephadexG-10凝胶色谱系统中，理论上β-内酰胺抗生素三聚体以上高分子杂质均集中在Kav=0色谱峰中；调整各种色谱条件，既可使β-内酰胺抗生素寡聚物（如青霉素类抗生素二聚物等）和其它高分子杂质分离，又可使其二者合二为一，所以可用于不一样分析目标。8/29/202332内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第32页高分子杂质分析方法三、色谱条件对β-内酰胺类抗生素在SephadexG-10凝胶色谱系统中色谱行为影响8/29/202333内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第33页色谱条件影响1.流动相离子强度对溶质保留行为影响：流动相离子强度和色谱行为即使并无直接联络，但普通说来，当流动相中离子种类不改变时，离子强度越大，β-内酰胺类抗生素Kav值越大。

8/29/202334内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第34页在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量缓冲盐以改进色谱峰形和分离效果。有研究表明，在流动相中添加中性盐如氯化钠或增加缓冲液浓度后，均使离子强度增加，使β-内酰胺类抗生素中高分子杂质得到有效分离。8/29/202335内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第35页色谱条件影响2.流动相种类对溶质色谱行为影响：惯用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。改变流动相中缓冲液种类，能够改变溶质色谱行为，对β-内酰胺类抗生素，表现为其Kav值改变及色谱峰型改变。

8/29/202336内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第36页流动相0.1mol/L头孢菌素Kav值头孢他啶头孢曲松头孢噻吩柠檬酸缓冲液0.452.522.06硫酸铵0.361.761.45磷酸缓冲液0.311.361.42醋酸缓冲液0.270.791.00碳酸盐缓冲液0.210.550.88硝酸钠0.150.210.58流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为影响8/29/202337内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第37页测定次数缓冲盐0.1mol/L理论板数拖尾因子1磷酸缓冲液31911.43柠檬酸缓冲液23852.542磷酸缓冲液41211.43柠檬酸缓冲液31202.40流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为影响8/29/202338内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第38页分析证实，影响这种改变决定原因是缓冲液中阴离子种类，阴离子所带负电荷越多，溶质Kav值相对越大，色谱峰也越易拖尾。8/29/202339内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第39页色谱条件影响3.流动相pH影响

对于弱酸，流动相pH值越小，组分k值越大，当pH值远远小于弱酸pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。当流动相中有多元酸/盐存在时，pH经过影响多元酸解离，改变缓冲液中阴离子类型，来改变溶质保留时间。8/29/202340内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第40页色谱条件影响4.洗脱速度影响流速越大，溶质保留值减小。反之，溶质保留值增大。这是因为流速较快时，溶质分子进入凝胶颗粒内部概率减小，造成与葡聚糖凝胶相互作用机会降低之故。8/29/202341内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第41页色谱条件影响5.溶质保留值和半峰宽关系β-内酰胺抗生素在SephadexG-10凝胶色谱系统中半峰宽与其保留时间均呈线性关系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰型越难看。8/29/202342内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第42页第三节分子排阻色谱法中国药典版二部要求，分子排阻色谱法是依据待测组分分子大小进行分离一个液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱分子筛机制。β-内酰胺类抗生素中高分子杂质测定采取分子排阻色谱法。8/29/202343内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第43页本身对照外标法原理——

在SephadexG-10凝胶色谱系统中，因为SephadexG-10排阻分子量仅为700道尔顿，所以，除部分寡聚物外，β-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留；即全部高分子杂质表现为单一色谱峰，其kav=0。

8/29/202344内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第44页本身对照外标法在特定条件下，β-内酰胺抗生素因为分子间氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作用，能够形成缔合物，造成其表观分子量增大。此时，在SephadexG-10凝胶色谱系统中和高分子杂质含有相同色谱行为，即在kav=0处表现为单一色谱峰。8/29/202345内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第45页本身对照外标法测定方法——利用以上所述原理，在SephadexG-10凝胶色谱系统中，以药品本身为对照品，测定其在特定条件下缔合时峰响应指标；再改变色谱条件，测定样品高分子杂质和药品分离后，kav=0处高分子杂质峰响应指标；按外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于药品本身相对含量。流动相B：水流动相A：磷酸盐缓冲液8/29/202346内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第46页为何采取本身对照外标法？定量分析法理论基础：经过检测器物质量与检测器响应信号成正比，其检测器响应能够是面积或峰高。含量响应值(A或H)定量方法：外标法

内标法峰面积归一法主成份对照法8/29/202347内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第47页

1.外标法以待测物质对照品为参考物，依据供试品量和对照品量以及对应响应信号进行定量方法。

高聚物对照品较难制备，即使制备高聚物对照品因为不稳定也较难保留，而且不一样批制备对照品极难同质。β-内酰胺抗生素高分子杂质含有高度不均一性和不确定性。8/29/202348内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第48页2.归一化法将测得色谱图上，全部色谱峰面积求和，与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰百分比，把全部色谱峰百分比相加即得100%，称为峰面积归一化。

对于高分子杂质来说，其含量和药品本身含量相差甚远，测量误差较大。8/29/202349内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第49页高分子杂质样品主峰8/29/202350内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第50页3.内标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法优点一个方法，它在加入内标后，按峰面积归一法分析方法进行分析，这就防止了因为进样一致性及样品歧视效应造成偶然误差，因而，它分析精密度也是比较高，是气相色谱一个比较理想定量分析方法。

8/29/202351内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第51页4.主成份对照法因为SephadexG-10凝胶色谱分离系统柱效较低，进样微量药品极难表现出众谱峰。8/29/202352内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第52页基本分析方法8/29/202353内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第53页仪器1.恒流泵1）转速转速范围：0.1-120rpm,正反转可逆

2）调速方式：无级调速配以线性数码旋钮连续可调

3）速度分辩率：30rpm以下为0.1rpm，30rpm以上为1rpm硅胶管

1）粗细适当2）壁厚1.5mm3）耐磨8/29/202354内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第54页仪器2.玻璃层析柱合理选择层析柱长度和直径，是确保分离效果主要步骤，理想层析柱直径与长度之比普通为1：25～1：100.8/29/202355内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第55页仪器3.检测器β-内酰胺抗生素通常都有较显著紫外吸收特征，所以测定中普通选择紫外检测器，通惯用到检测波长是254nm。8/29/202356内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第56页仪器3.数据处理系统

积分仪选择性统计,进行积分处理和定量计算色谱工作站色谱控制\数据采集\统计\计算\分析\图谱保留\试验结果编排\打印于一体8/29/202357内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第57页系统适用性试验1.以蓝色葡聚糖保留时间来表示高分子杂质保留特征，考查对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖溶液色谱峰保留时间比值均应不超出某一程度。

中国药典要求是0.93～1.07。对照品峰和供试品溶液聚合物峰与对应色谱中蓝色葡聚糖峰保留时间比值也是0.93～1.07。8/29/202358内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第58页流动相A：磷酸盐缓冲液流动相B：水5.3495.1868/29/202359内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第59页2.理论板数在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖峰计算，理论板数均大于700。8/29/202360内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第60页3.拖尾因子在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖峰计算，拖尾因子均小于2.0。8/29/202361内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第61页4.重复性RSD考查对照品在流动相B系统中重复进样后峰面积相对标准偏差应符合要求。8/29/202362内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第62页流动相B：水测定对照品，在Kav=0处表现为单一色谱峰，以药品本身为对照品，测定这一条件下缔合时峰响应指标。5.305测定过程8/29/202363内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第63页流动相A：磷酸盐缓冲液测定供试品，测定样品中高分子杂质和药品分离后，Kav=0处高分子杂质峰响应指标。5.3458/29/202364内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第64页影响准确测定若干原因1.峰响应值选择2.检测器类型及其线性范围3.进样量影响4.对照品异质性影响8/29/202365内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第65页分离度定义：分离度是指高分子聚合物与药品单体之间分离程度（或分离能力）。Hp——次高峰到基线高。Hv——次高峰与最大峰曲线分离最低点到基线高。

8/29/202366内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第66页分离度影响原因1.凝胶对药品吸附作用强弱与结构相关2.与洗脱剂组成相关3.与流动相离子强度相关4.与流动相pH相关5.与流动相流速相关8/29/202367内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第67页第四节SephadexG-10凝胶色谱系统相关试验技术1.凝胶预处理凝胶：溶胶或溶液中胶体粒子或高分子在一定条件下相互连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质液体（在干凝胶中也能够是气体），这么一个特殊分散体系称作凝胶。没有流动性。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于弹性凝胶弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀。

8/29/202368内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第68页凝胶粒度选择：普通来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。所以，如用细颗粒凝胶宜用大直径层析柱，用粗颗粒时用小直径层析柱。在实际操作中，要依据工作需要，选择适当颗粒大小并调整流速。

8/29/202369内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第69页凝胶溶胀方法：称取葡聚糖凝胶，迟缓地倾倒入5～10倍去离子水中或蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀

2小时，普通采取后一个方法（能除去凝胶中污染细菌，同时排除气泡）。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水重复洗涤几次，最终减压抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，准备装柱。

商品凝胶是干燥颗粒，使用时需经溶胀处理，依据所需凝胶体积，预计所需干胶量。普通葡聚糖凝胶吸水后凝胶体积约为其吸水量2倍，比如SephadexG-20吸水量为20，1克SephadexG─20吸水后形成凝胶体积约40ml。

8/29/202370内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第70页凝胶再生：

对于不锈钢色谱柱其方法是:先用水重复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。

对于玻璃层析柱其方法是：将凝胶从柱柱中取出，将已使用过凝胶先用0.2mol/L氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液浸泡半小时后，用水洗至中性，再装柱。

对于长久不使用硅胶其方法是：将洗好凝胶用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%和无水乙醇浸泡抽干，最终用乙醚浸泡抽干置37℃烘干后，即可长久保留。8/29/202371内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第71页2.装柱取层析柱一根，底部用玻璃纤维或砂蕊滤板衬托，并要求滤板下体积尽可能小。将柱垂直至于铁架上，然后在柱顶连接一长颈漏斗（漏斗颈直径约为柱直径二分之一）。在柱中加水或洗脱液，并赶净滤板下方气泡，使支持滤板底部完全充满液体，然后将柱出口关闭。把已经溶胀好凝胶调成薄浆，从漏斗倒入柱内，胶粒逐步扩散下沉，薄浆连续加入。

8/29/202372内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第72页装柱关键点：1）凝胶浆浓度应适宜（普通为70%水混悬液），分散均匀不结团（不宜强烈搅拌）。2）一根理想凝胶柱要求柱中填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。3）通常新装凝胶柱用适当缓冲溶液平衡后，将带色兰葡聚糖–溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以判定新装柱技术质量是否合格，不然，必须重新装填。8/29/202373内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第73页3.加样

加样方法：凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液迟缓渗透凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。

8/29/202374内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第74页加样量：加样量与测定方法和层析柱大小相关。假如检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；不然，加样量增大。普通来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液加入量应掌握在凝胶床总体积5％～10％。样品体积过大，分离效果不好。

8/29/202375内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第75页4.洗脱加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、及统计仪相连，依据被分离物质性质，预先预计好一个适宜流速。

凝胶柱层析普通都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制装置最好是恒流泵。

8/29/202376内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第76页色谱柱维护保养玻璃层析柱：1.装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求操作压下装柱，流速不宜过快，防止所以而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，造成层析过程中，凝胶床高度下降。2.一直保持柱内液面高于凝胶表面，不然水分挥发，凝胶变干。

8/29/202377内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第77页色谱柱维护保养3.葡聚糖凝胶耐受压力为0.3兆帕，过高压力会损伤填料性能。4.预防柱长霉：可用20%乙醇或0.04%叠氮钠保留。5.预防柱受污染：可用

0.2mol/L氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液清洗。8/29/202378内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第78页色谱柱维护保养不锈钢色谱柱：1.在高于室温条件下使用时，不要在测量完成马上停泵，应该是继续通流动相直到色谱柱温度低于室温为止。假如在色谱柱很热时候停泵，当流动相冷却过程中色谱柱就会进入气泡。8/29/202379内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第79页色谱柱维护保养2.若色谱柱在短期内不再使用，应用蒸馏水将含盐流动相从色谱柱中替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。3.色谱柱长久不用，应在4℃储备。若储备温度低于0℃，则会降低柱效。4.防止阳光直射，防止与腐蚀性气体接触。8/29/202380内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第80页总结反抗生素中高分子杂质分析依据不一样品种特点和不一样质控要求灵活掌握，优先采取凝胶色谱法，但不排除其它验证良好其它分析系统应用，对不一样品种，视分离情况和分离要求，将SephadexG-10和高效凝胶色谱系统综合应用。8/29/202381内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第81页总结高效、快速、简便是抗生素高分子杂质测定方法发展目标，也是必定趋势。在版中国药典中，发展较为完善SephadexG-10凝胶色谱系统对多个品种抗生素高分子杂质控制有着主要意义。现在已经有专门β-内酰胺抗生素聚合物测定仪，对β-内酰胺抗生素高分子聚合物检验方法研究将起到推进作用。8/29/202382内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第82页复习题一、1.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质：对药品中分子量大于药品本身杂质总称。其分子量普通在1000～5000，个别可至约10000道尔顿。2.分离度：是指高分子聚合物与药品单体之间分离程度（或分离能力）。8/29/202383内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第83页复习题1.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质按其起源分为：

和

。（外源性杂质、内源性杂质）2.青霉类抗生素高分子杂质有

杂质和

两大类。（蛋白（多肽）类杂质、聚合物杂质）3.青霉类抗生素样品在储存过程中，多肽类杂质不停生成，其反应速度与

和

相关。（水分含量、储存温度）4.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质含有

性和

性。5.青霉素聚合反应速度在溶液条件下和

关系亲密；在固体条件下主要和

含量相关。(溶液酸碱度、样品水分)6.葡聚糖凝胶耐受压力为

，过高压力会损伤填料性能。(0.3兆帕)7.色谱柱在短期内不再使用，应用

将含盐流动相从色谱柱中替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。（蒸馏水）8.色谱柱长久不用，应在

储备。若储备温度低于0℃，则会降低柱效。（4℃）

8/29/202384内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第84页复习题1.

内酰胺类抗生素高分子杂质测定中影响分离度原因（ABCD）A．与洗脱剂组成相关B．与流动相离子强度相关C．与流动相PH相关D．与流动相流速相关2.当流动相中离子种类不改变时，离子强度越大，β-内酰胺类抗生素Kav值（B）。A.越小B.越大C.不变D.没有影响3.当改变流动相离子种类时，其Kav值会随之改变，决定这种改变原因是流动相中阴离子种类，阴离子所带负电荷越多，溶质Kav值相对（B）A.越小B.越大C.不变D.没有影响4.在色谱过程中，除分子排阻作用外，凝胶对药品分子吸附作用与对高分子杂质吸附作用相比（C）A.小于B.等于C.大于D.不一定

8/29/202385内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第85页复习题1.简述影响β-内酰胺类抗生素中高分子杂质形成原因？1)青霉素聚合物聚合反应速度在溶液条件下和溶液酸碱度关系亲密；在固体条件下主要和样品水分含量相关。2)头孢菌素聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度关系亲密。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至37℃时，含水量差异对聚合物含量影响十分显著。

8/29/202386内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第86页复习题2.简明说明凝胶色谱分离原理？利用凝胶色谱分子筛机制，但凝胶孔径要比分子筛大得多，普通为几百至几千埃。让药品分子自由进入凝胶颗粒内部，而全部高分子杂质被排阻，进而实现让全部高分子杂质含有相同保留时间构想。

8/29/202387内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第8