核酸的制备和提取

核酸的制备和提取核酸的制备和提取第1页第一部份、核酸基础知识；第二部份、常见核酸制备方法；学习内容核酸的制备和提取第2页第一部份、核酸基础知识第一节

核酸研究历史；第二节核酸化学组成；第三节核酸结构特点；核酸的制备和提取第3页1868年瑞士科学家米歇尔(F.Miescher)发現细胞核內含高量磷酸性物质，命名为核素(后更名为核酸)早期研究仅将核酸看成是细胞中普通化学成份，没有些人注意到它在生物体内有什么功效；第一节、核酸发觉F.Miescher核酸的制备和提取第4页核酸作为遗传物质发現过程20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是由四种不一样碱基所组成；美国科学家列文(Levene)又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；1928英国科学家格里菲斯(Griffith)利用细菌性狀转变试验，证实了遗传信息可传递性；1944美国科学家艾佛瑞(Avery)证实了DNA造成细菌性狀转变物质基础；1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase)证明遗传物质是DNA非蛋白质；1953年，英国科学家沃森和克里克发觉了DNA双螺旋结构；核酸的制备和提取第5页一核酸概念和主要性(一)概念 由核苷酸或脱氧核苷酸经过3′，5′-磷酸二酯键连接而成一类生物大分子，含有非常主要生物功效，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。包含核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。(二)主要性1.与生命活动关系亲密，是主要生命物质。生命起源、生长、发育、衰老、死亡与之相关。2.核酸研究是当代生物医学研究关键。第二节、核酸组成核酸的制备和提取第6页二、核酸类别、分布和组成（一）、类别：核酸(nucleicacid)分为:脱氧核糖核酸(DNA,deoxyribonucleicacid)与核糖核酸(RNA,ribonucleicacid)。核糖核酸（RNA）分成以下几类：

1、信使RNA（mRNA）

2、转移RNA（tRNA）

3、核糖体RNA（rRNA）

4、其它非编码RNA(snRNA,microRNA)核酸的制备和提取第7页（二）、核酸分布：1、DNA分布：真核生物细胞核，线粒体亦含有DNA.原核生物集中于核区，核外质粒病毒含有DNA或RNA.2、RNA分布存在于细胞质和细胞核中。发觉了许多新含有特殊功效RNA：如反义RNA，核酶等.

病毒和亚病毒RNA有许各种：正链RNA、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等.

核酸的制备和提取第8页（三）核酸组成1.组成基础单位:核苷酸2.组成元素:C、H、O、N、P核酸的制备和提取第9页RNA为D-核糖，DNA为D-2-脱氧核糖，二者都是β

型。差异：2位羟基是否脱氧。（1）核酸中糖核酸的制备和提取第10页（2）碱基：a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(Gua)b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧啶(Thy)核酸的制备和提取第11页

（3）核苷：戊糖与碱基经过β-糖苷键相连，C—N糖苷键。糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。依据核苷中所含戊糖不一样，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。核酸分子中碱基或核苷酸修饰非经常见，如DNA甲基化，RNA转录后修饰。核酸的制备和提取第12页

碱基相连（核苷）酯键（4）核苷酸核酸的制备和提取第13页一切生物遗传物质——核酸核酸脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）基础组成单位主要在细胞核染色体上，少数在线粒体和叶绿体主要在细胞质中基础组成单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖：脱氧核糖碱基：磷酸A、G、C、T脱氧核糖碱基磷酸A腺嘌呤G鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸C胞嘧啶T胸腺嘧啶五碳糖：核糖碱基：磷酸A、G、C、U核糖碱基磷酸A腺嘌呤G鸟嘌呤核糖核苷酸C胞嘧啶U尿嘧啶核酸的制备和提取第14页一、核酸一级结构（一）核酸中核苷酸连接方式DNA、RNA中脱氧核苷酸、核苷酸是经过3‘，5‘–磷酸二酯键连接。表示方法：书写次序5‘——3’。核酸一级结构是指核酸分子中各核苷酸残基以磷酸二酯键连接、沿多核苷酸链排列次序。第三节、核酸结构核酸的制备和提取第15页核苷酸组成与连接核酸的制备和提取第16页DNA

一

级

结

构

图

示核酸的制备和提取第17页（二）一级结构表示方法（1）线条式：竖线碳链、碱基、磷酸（2）文字式：

5＇pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3＇DNA

5＇pＡpＣpＵpＵpＧpＡpＡpＣpＧ3＇RNA

此式可深入简化为：

5＇ＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3＇

5＇ＡＣＵＵＧＡＡＣＧ3＇核酸的制备和提取第18页2、一级结构特点

DNA相对分子量非常大，能编码信息量十分巨大。细菌基因是连续,无内含子功效相关基因组成操纵子，有共同调控序列，较少重复序列。真核生物基因是断裂，有内含子功效相关基因不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列,又分为高度重复、中度重复、单一序列。另外还有回文结构.越是高等真核生物其调控序列和重复序列百分比越大。1、DNA一级结构DNA一级结构A、T、G、C经过3`，5`-磷酸二酯键连接，C’1—碱基，C’2——脱氧。碱基：A、T、G、C；脱氧核糖；没有侧链核酸的制备和提取第19页二、DNA二级结构（1）、模型建立依据：

Chargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物DNA碱基组成。结果显示：摩尔数A=T；G=C；A+C=G+T；A+G=C+T核酸的制备和提取第20页腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶碱基之间形成氢键模型核酸的制备和提取第21页双螺旋平面图ThedoublehelixmaintainsaconstantwidthbecausepurinesalwaysfacepyrimidinesinthecomplementaryA-TandG-Cbasepairs.ThesequenceinthefigureisT-A,C-G,A-T,G-C.核酸的制备和提取第22页（2）DNA双螺旋特点：A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋；B、骨架：内侧碱基垂直于纵轴； 外侧-磷酸与戊糖、彼此经过3’、5’磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。 大沟宽1.2nm，深0.85nm； 小沟宽0.6nm，深0.75nm；C、直径：2nm，二相邻碱基高度0.34nm，二核苷酸夹角36度，旋转一周10个核苷酸，一周高度3.4nm；核酸的制备和提取第23页三、DNA三级、四级结构：细长分子以一个高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋深入扭曲就组成了三级结构。超螺旋，三级结构中一个。DNA压缩总标准：多级螺旋，4级压缩。真核原核核酸的制备和提取第24页基因A基因B基因区间核酸的制备和提取第25页四、RNA分子结构与功效（一）、RNA类别

1信使RNA(messengerRNA,mRNA); 2转移RNA(transferRNA,tRNA); 3核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA);核酸的制备和提取第26页核酸的制备和提取第27页（二）、RNA结构特点RNA与DNA结构十分相同，二者相比有几点不一样：（1）核糖：（2）碱基：A、G、C、U（3）二者在三维结构上区分——RNA不含有规则氢键结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成突环。核酸的制备和提取第28页1、mRNA核酸的制备和提取第29页5‘Cap功效：3’PolyA功效：核酸的制备和提取第30页AlatRNA结构示意图2、tRNA：转运氨基酸核酸的制备和提取第31页tRNA有“接头”(adaptor)功效，具备双重特征；识别氨基酸——其3’末端腺苷酸可与一氨基酸共价连接识别密码子——反密码子与mRNA中密码子碱基配对。核酸的制备和提取第32页6、rRNArRNA占RNA总量80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几个rRNA和数十种蛋白质组成。rRNA与几十种蛋白质组成细胞颗粒——核糖体是细胞内合成蛋白质工厂。核糖体上催化肽键合成是rRNA，蛋白质只是维持rRNA构象，起辅助作用。核酸的制备和提取第33页核酸的制备和提取第34页转录翻译场所：核糖体场所：细胞核核酸的制备和提取第35页其它RNA结构与功效不均一核内RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)：hnRNA是mRNA未成熟前体。细胞内有小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spilceosome)主要成份，参加mRNA前体加工过程。核仁小分子RNA(snoRNA)负责rRNA加工(切割和修饰)由内含子编码。染色质RNA(chromosomeRNA),稳定基因组DNA作用。核酸的制备和提取第36页第一节核酸分离纯化设计及标准第二节基因组DNA分离纯化第三节质粒DNA提取与纯化第四节RNA分离纯化第二章、核酸分离技术第五节核酸保留与判定核酸的制备和提取第37页

1、保持核酸分子结构完整性；

2、尽可能去除其它分子污染，确保核酸纯度；

应尽可能简化分离纯化步骤，缩短提取时间

尽可能防止各种有害原因对核酸破坏第一节核酸分离纯化设计及标准核酸的制备和提取第38页一、核酸分子提取技术路线I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸的制备和提取第39页

（一）核酸释放细胞破碎方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法核酸的制备和提取第40页（二）核酸分离与纯化：应该去除杂质主要包含三个别

1、非核酸大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类物质等

2、非需要核酸分子：分离某一特定核酸分子时，其它核酸分子皆为杂质；

3、加入有机溶剂和一些金属离子核酸的制备和提取第41页（三）核酸浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常见方法常见盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常见有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀经常含有少许共沉淀盐，需用70%～75%乙醇洗涤去除二、技术路线设计核酸的制备和提取第42页破碎细胞核酸从细胞中游离出来沉淀核酸除去蛋白质乙醇酚和氯仿核酸提取过程核酸的制备和提取第43页

基因组DNA特点：

1.分子大，轻易断裂

2.轻易污染其它起源DNA分离纯化方法：1.酚抽提法2.甲酰胺解聚法3.玻棒缠绕法4.异丙醇沉淀法第二节真核基因组DNA分离纯化核酸的制备和提取第44页DNA酚抽提法示意图

一、酚抽提法核酸的制备和提取第45页基因组DNA提取---酚抽提法样品准备细胞裂解蛋白质变性DNA抽提DNA沉淀核酸的制备和提取第46页血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试剂盒细胞基因组DNA试剂盒核酸的制备和提取第47页DNA柱层析法示意图核酸的制备和提取第48页第三节质粒DNA提取与纯化质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色细菌类群中发觉质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传辅助性遗传单位。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表示主要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中含有极广泛应用价值，而质粒分离与提取则是最常见、最基础试验技术。核酸的制备和提取第49页核酸的制备和提取第50页质粒特征1.分子相对小2.含有高效自主复制成份3.不相容性4.转移性5.选择标识6.限制性内切酶单一切。核酸的制备和提取第51页核酸的制备和提取第52页质粒DNA提取和纯化1．细菌培养

先分离单个菌落，接种到含少许适当抗生素培养基中扩增，伴随细菌生长，质粒DNA也在自主复制。质粒DNA小量制备2-5ml质粒DNA大量制备500ml{核酸的制备和提取第53页2．细菌搜集细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提升质粒DNA纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上液体也应该仔细去除洁净

核酸的制备和提取第54页

碱裂解法 煮沸法

SDS裂解法

Triton-溶菌酶法3．细菌裂解方法4．质粒DNA提取---适合用于大质粒DNA---不宜含糖高菌株如HB101核酸的制备和提取第55页核酸的制备和提取第56页

选择性地使用RNase变性剂（如酚、氯仿及强烈胍类变性剂）设置专门RNA移液装置；使用蛋白酶K和阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠;准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶器皿,DEPC处理水等;一、RNA制备条件与环境第四节真核细胞RNA分离纯化核酸的制备和提取第57页细胞RNA含量

每个细胞RNA量约为10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA

其它RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…核酸的制备和提取第58页核酸的制备和提取第59页核酸判定浓度判定纯度判定完整性判定核酸保留DNA储存RNA储存第五节核酸判定与保留核酸的制备和提取第60页一、核酸浓度判定（1）紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中碱基含有共轭双键结构因而能够吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。

DNA或RNA定量，OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸核酸的制备和提取第61页浓度判定紫外分光光度法：测定DNA在A260nm光吸收值。如计算DNA浓度

A260×稀释倍数×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml核酸溶液。(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，20μg/ml单链寡核苷酸）核酸的制备和提取第62页⑵荧光光度法：核酸荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度积分与溶液中核酸含量呈正比。适合用于低浓度核酸溶液定量分析。（1-5ng）核酸的制备和提取第63页核酸的制备和提取第64页3.DNA分子片断测定应用凝胶电泳能够正确地测定DNA片段分子大小。电泳完成后，经澳化乙锭染色，摄影，从照片上比较待测样品中DNA片段与标准样品中哪一条带最靠近，即可推算出未知样品中各片段大小。核酸的制备和提取第65页

⑴紫外分光光度法：该法主要经过A260与A280比值来判定有没有蛋白质污染，比值升高与降低均提醒不纯。判断核酸样品纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0二、核酸纯度判定纯DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染纯RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染核酸的制备和提取第66页⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪核酸电泳结果可判定核酸制品纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。核酸的制备和提取第67页⑴DNA完整性测定：以EB为示踪剂核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品完整性。基因组DNA片段分子量很大，在电场中泳动很慢，假如发生降解，电泳图呈拖尾状。三、核酸完整性判定DNA片段降解核酸的制备和提取第68页质粒DNA完整性测定：核酸的制备和提取第69页完整或降解极少总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定比值，沉降系数大核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。

普通而言，28S（23S）RNA荧光强度约为18S（16S）RNA2倍，不然提醒有RNA降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA污染。三（2）RNA完整性测定：

总RNA电泳图谱核酸的制备和提取第70页

正常时，28SRNA荧光强度约为18SRNA2倍，不然提醒RNA降解核酸的制备和提取第71页1、短期贮存：

4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。

TE缓冲液PH与DNA贮存相关，PH为8时，可降低DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA轻易变性。2、长久贮存：

TE缓冲液中-70℃保留数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效预防细菌和核酸污染。（二）核酸保留

---DNA储存核酸的制备和提取第72页RNA溶于0.3mol/LNaAc溶液或三蒸水中，-70℃保留。注意防止Rnase污染；分装，防止重复冻融；如用DEPC处理过水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保留时间可延长。2、RNA储存核酸的制备和提取第73页核酸的制备和提取第74页格里菲斯细菌性状转变试验肺炎双球菌S型有致病力R型无致病力老鼠死亡血液中分离出S型菌老鼠存活血液中分离不出R型菌核酸的制备和提取第75页格里菲斯细菌性状转变试验活S型菌活R型菌死S型菌活R型菌＋加热杀死S型菌活S型菌核酸的制备和提取第76页艾佛瑞证实了DNA促使细菌转型将细胞打坏取出萃取物1.DNA分解酶2.RNA分解酶3.蛋白质分解酶＋＋＋假设：S型菌含有某种物质促使R型菌发生转型S型菌R型菌R型菌R型菌R型菌S型菌S型菌核酸的制备和提取第77页赫雪、蔡斯证实了DNA为遗传物质以T2噬菌体和大肠杆菌作为材料；目标：欲知是何种物质可作为噬菌体遗传物 质，DNA？还是蛋白质外鞘？利用放射性同位素：35S标定噬菌体蛋白质

32P标定噬菌体DNA蛋白质外鞘DNA核酸的制备和提取第78页噬菌体侵染细菌试验核酸的制备和提取第79页核酸的制备和提取第80页核酸的制备和提取第81页多基因表型:肤色多基因表型:身高核酸的制备和提取第82页数量性状多基因表型核酸的制备和提取第83页核酸——遗传物质基础

基因是全部生物体遗传信息载体，是决定生老病死等全部现象基础元素。基因物质基础是核酸分子。核酸的制备和提取第84页人类健康是受内因和外因共同影响。外因：个体外在原因60%内因：个体遗传原因决定40%核酸的制备和提取第85页遗传原因为主外因为主血友病高血压肿瘤一型糖尿病外伤

全部疾病发生都与基因亲密相关核酸的制备和提取第86页核酸的制备和提取第87页叶绿体中含有环状DNA细菌等原核生物质粒染色体线粒体中含有环状DNA核酸的制备和提取第88页核苷酸基础结构MonophosphateDiphosphateTriphosphateAdenineGuanineThymineCytosineUracilNucleoside(Adenosine)Nucleotide(Adenosinemonophosphate,AMP)PurinePyrimidine核苷核苷酸磷酸五环糖Ribose,Deoxyribose碱基1’2’3’4’5’核酸的制备和提取第89页

高速捣碎法：将组织加盐水(约1／3～1／2)装入捣碎机桶内。用10000r／min间断离心，每次30～60s，预防离心时间过长产生热破坏抗原活性。

高速组织捣碎机高速捣碎法核酸的制备和提取第90页玻璃匀浆器

研磨法用玻璃匀浆器。主要经过旋转、挤压等方式将组织粉碎。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子破坏也少。该法可用于粉碎少许软嫩材料（脑、胰、肝等）时常见方法。

玻璃匀浆器核酸的制备和提取第91页

常见酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等

酶处理法

方法：在一定条件下，能消化细菌和组织细胞。

特点：①此法适用各种微生物；②含有作用条件温和；③内含物成份不易受到破坏；④细胞壁损坏程度能够控制。核酸的制备和提取第92页

原理：在适当温度、pH及低离子强度条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜渗透性改变或使之溶解。表面活性剂处理

常见有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。

应用：①破碎细菌，且作用比较温和；②提取基因组或质粒DNA常见破碎方法。核酸的制备和提取第93页核酸的制备和提取第94页

各种碱基紫外吸收光谱核酸的制备和提取第95页EB与DNA结合核酸的制备和提取第96页核酸的制备和提取第97页核酸理化性质在细胞内通常与蛋白