发酵工程发酵工业的无菌技术

发酵工程发酵工业的无菌技术发酵工程发酵工业的无菌技术第1页4.1发酵工业无菌处理灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中全部有生命物质过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面微生物。

除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中微生物及其孢子。

防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物生长和繁殖。发酵工程发酵工业的无菌技术第2页控制有害微生物主要有以下几个办法：杀灭病原微生物杀灭一切微生物发酵工程发酵工业的无菌技术第3页

比较项目灭菌消毒防腐化疗处理原因强、理化原因理、化原因理、化原因化学治疗剂处理对象任何物体内外生物体表，酒、乳等有机物体内外宿主体内微生物类型一切微生物相关病原菌一切微生物相关病原菌对微生物作用彻底杀灭杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死实例加压蒸气灭菌，辐射灭菌、化学杀菌剂70%酒精消毒、巴氏消毒法冷藏、干燥、糖渍、盐腌、缺氧、化学防腐剂抗生素、磺胺药、生物药品素发酵工程发酵工业的无菌技术第4页4.2发酵工业污染防治策略什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖。发酵工程发酵工业的无菌技术第5页1）因为杂菌污染，使发酵培养基因杂菌消耗而损失，造成产率下降；2）因为杂菌所产生一些代谢产物，或染菌后发酵液一些理化性质改变，使产物提取变得困难，造成得率降低或使产品质量下降；3）污染杂菌可能会分解产物而使生产失败；4.2.1杂菌污染危害

发酵工程发酵工业的无菌技术第6页4）污染杂菌大量繁殖，会改变反应介质pH，从而使生物化学反应发生异常改变；5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生产失败等。发酵工程发酵工业的无菌技术第7页染菌危害详细分析

（1）染菌对不一样菌种发酵影响A．细菌谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷（枯草杆菌）：缺点型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成份快速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。发酵工程发酵工业的无菌技术第8页B.霉菌PenG：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶杂菌，都能使青霉素快速破坏。青霉素水解酶上升，PenG快速破坏，发酵一无所获。柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要预防前期染菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第9页链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不一样程度危害。如杂菌大量消耗营养，干扰生产菌正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。发酵工程发酵工业的无菌技术第10页青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染发酵工程发酵工业的无菌技术第11页C.酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌

D.疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采取深层培养，这是一类不加提纯而直接使用产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。所以，发酵罐容积越大，污染杂菌后损失也越大。发酵工程发酵工业的无菌技术第12页污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程通气搅拌。有杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸产品破坏。尤其是染芽孢杆菌，因为芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会重复染菌。

发酵工程发酵工业的无菌技术第13页因为接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养基营养丰富，轻易污染杂菌。种子染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）不一样发酵时期染菌对发酵影响

1）种子培养期染菌发酵工程发酵工业的无菌技术第14页

2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌。原因发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生极少，抵抗杂菌能力弱。在这个时期要尤其警觉以预防染菌发生。办法假如前期染菌，且培养基养料消耗不多，能够重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。发酵工程发酵工业的无菌技术第15页发酵中期染菌，处理困难，危害很大。3）发酵中期染菌

发酵中期染菌会严重干扰产生菌代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌降低或停顿，有时甚至会使已产生产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。办法降温培养，降低补料，亲密注意代谢改变情况。假如发酵单位抵达一定水平能够提前放罐，或者抗生素生产中能够将高单位发酵液输送一个别到染菌罐，抑制杂菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第16页4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量产物，尤其是抗生素，对杂菌有一定抑制或杀灭能力。所以假如染菌不多，对生产影响不大。假如染菌严重，又破坏性较大，能够提前放罐。发酵工程发酵工业的无菌技术第17页（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量影响1）发酵染菌对过滤影响染菌发酵液普通发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或极难形成滤饼，造成过滤困难。发酵工程发酵工业的无菌技术第18页污染杂菌种类对过滤影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时极难过滤。因为过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提取总收率。发酵工程发酵工业的无菌技术第19页丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不停下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难

预处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采取溶媒萃取提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化发酵工程发酵工业的无菌技术第20页染菌发酵液中含有比正常发酵液更多水溶性蛋白和其它杂质。采取有机溶剂萃取提炼工艺，则极易发生乳化，极难使水相和溶剂相分离，影响深入提纯。采取直接用离子交换树脂提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂交换容量，而且有杂菌极难用水冲洗洁净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响深入提纯。发酵工程发酵工业的无菌技术第21页4.2.2杂菌污染防治

1.染菌检验与判断显微镜检验法镜检出杂菌需要一定时间平板划线培养或斜面培养检验法：菌落噬菌体检验可采取双层平板法：噬菌斑肉汤培养检验法发酵过程异常现象判断DO2水平异常改变pH异常改变尾气CO2异常改变

发酵工程发酵工业的无菌技术第22页双层平板法底层平板（2％琼脂培养基10mL）上层平板上层培养基（1％琼脂培养基5mL）宿主菌悬液（对数期菌液0.2mL）噬菌体试样（适当稀释液0.1mL）混匀37℃10余h计数噬菌斑发酵工程发酵工业的无菌技术第23页溶解氧水平异常改变感染噬菌体，生产菌作用受到抑制，溶氧浓度很快上升。

污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并靠近零值，长时间不能回升；

污染非好氧性杂菌，生产菌受到抑制，耗氧量降低，溶解氧升高。发酵工程发酵工业的无菌技术第24页12发酵工程发酵工业的无菌技术第25页尾气中CO2含量异常污染杂菌，糖耗加紧，CO2含量增加；感染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量降低。pH异常对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快杂菌，会使pH快速下降。发酵工程发酵工业的无菌技术第26页2.污染原因分析

主要原因：

①

种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底

⑤操作失误⑥技术管理不善

发酵工程发酵工业的无菌技术第27页日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析项目百分率%种子带菌或怀疑种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94发酵工程发酵工业的无菌技术第28页1）从污染杂菌种类分析污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底；污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题；污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引发；污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。发酵工程发酵工业的无菌技术第29页2）从污染时间分析发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作不妥或空气带菌；发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。3）从染菌程度分析多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；个别罐染菌：设备问题、操作不妥。发酵工程发酵工业的无菌技术第30页3.预防（1）种子带菌及其防治—发酵前期种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是能够克服。种子培养过程染菌与发酵一样有许多原因造成。发酵工程发酵工业的无菌技术第31页培养基及器具彻底灭菌—灭菌锅使用防止菌种在移接过程中受污染—无菌室防止菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染发酵工程发酵工业的无菌技术第32页无菌室要求在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地.接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，确保无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，确保无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦洁净。发酵工程发酵工业的无菌技术第33页发酵工程发酵工业的无菌技术第34页（2）过滤空气带菌及其防治从日本工业技术院分析空气带菌而造成染菌为19.96％。我国外空气除菌技术虽已经有较大改进，但依然没有使染菌率降低到理想程度。因为空气除菌系统较为复杂，步骤多，不慎便会造成空气除菌失败。发酵工程发酵工业的无菌技术第35页正确选择采气口保持过滤介质干燥设计和安装合理空气过滤器发酵工程发酵工业的无菌技术第36页（3）设备渗漏或“死角”

设备渗漏包含夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发觉，这类染菌占33.85％。所以说加强设备本身及从属零部件严密度检验，对制服染菌是极其主要，也是主要。发酵工程发酵工业的无菌技术第37页密闭式发酵罐发酵工程发酵工业的无菌技术第38页发酵工程发酵工业的无菌技术第39页发酵工程发酵工业的无菌技术第40页2、机械搅拌发酵罐结构

好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包含：罐身轴封消泡器搅拌器联轴器中间轴承挡板空气分布管换热装置人孔以及管路等发酵工程发酵工业的无菌技术第41页发酵工程发酵工业的无菌技术第42页

“死角”

发酵罐“死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”

消除方法：加强清洗并定时铲除污垢；安装放汽边阀管道安装不妥或配置不合理形成“死角”

发酵工程发酵工业的无菌技术第43页灭菌时蒸汽不易通达“死角”及其消除方法发酵工程发酵工业的无菌技术第44页发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”发酵工程发酵工业的无菌技术第45页法兰连接不妥造成“死角”发酵工程发酵工业的无菌技术第46页（4）灭菌不彻底灭菌技术好坏与灭菌质量很相关系升温快慢、保温时间,泡沫蒸汽总压是否到达要求标准环境中杂菌数量因季节而有很大差异。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于酷热夏季将连续灭菌预热至80℃培养基采样培养，可发觉无法计数大量芽孢杆菌；而在冬季取样培养中，则仅发觉2～3个芽孢杆菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第47页培养基与设备灭菌不彻底防治原料性状：大颗粒原料过筛除去实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气灭菌过程中产生泡沫造成染菌：添加消泡剂预防泡沫升顶连消不彻底：最好采取自动控制装置灭菌后期罐压骤变

死角操作不妥造成染菌

噬菌体染菌及其防治

发酵工程发酵工业的无菌技术第48页4.3发酵工业无菌技术——灭菌方法干热灭菌法

湿热灭菌法

射线灭菌法

化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法

发酵工程发酵工业的无菌技术第49页1）化学试剂灭菌法：常见试剂有甲醛、氯气（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）、臭氧等。这些物质易与微生物细胞中一些成份产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。因为化学试剂也会与培养基中一些成份作用，而且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基灭菌，但染菌后培养基可用化学药剂处理。

发酵工程发酵工业的无菌技术第50页2）辐射灭菌：利用高能量电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。如紫外线（穿透力低，仅适合用于表面消毒和空气消毒）与菌体核酸光化学反应而使菌体死亡；0.01-0.14nmX射线、Co60产生γ射线，它们含极高能量，可使菌体内水和有机物产生强烈离子化反应，形成OH-、H2O2和有机过氧化物，从而在微生物体内引发氧化连锁反应，造成微生物菌体快速死亡。多年兴起了微波灭菌。

发酵工程发酵工业的无菌技术第51页3）过滤除菌法适合用于澄清液体和气体除菌。是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径细菌等微生物颗粒阻留，从而到达除菌目标。用于遇热轻易变性而失效试剂或培养液。

发酵工程发酵工业的无菌技术第52页4）干热灭菌法160℃下保温1-2h。干热对微生物有氧化、使细胞蛋白质变性和电解质浓缩等效应而使菌体死亡。5）火焰灭菌法灭菌彻底，但仅适合用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等灭菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第53页6）湿热灭菌法：湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这首先是因为湿热易于传递热量，蒸汽含有很强穿透能力，而且在冷凝时会放出大量冷凝热，另首先是因为湿热更易破坏保持蛋白质稳定性氢键等结构，从而加速其变性。很轻易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。普通湿热灭菌条件：121℃，30min。发酵工程发酵工业的无菌技术第54页高压蒸汽灭菌是发酵工业最常见方法，能有效地杀灭杂菌，但高温也破坏培养基营养成份。

发酵工程发酵工业的无菌技术第55页消除高温有害影响办法（1）对易破坏含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其它成份分别灭菌后再合并；（2）对含Ca2+或Fe3+培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；发酵工程发酵工业的无菌技术第56页（3）对含有在高温下易破坏成份培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（4）在大规模发酵工业中，可采取连续加压灭菌法进行培养基灭菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第57页7)间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适合用于不耐热培养基灭菌。方法是：将待灭菌培养基在80～100℃下蒸煮15～60min，以杀死其中全部微生物营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下到达彻底灭菌效果。发酵工程发酵工业的无菌技术第58页4.4发酵培养基及设备管道灭菌热死时间---衡量湿热灭菌指标是指在要求温度下杀死一定百分比微生物所需要时间。加热温度和受热时间是灭菌工作关键。发酵工程发酵工业的无菌技术第59页湿热灭菌原理1微生物热阻杀死微生物极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下致死时间与另一微生物在相同条件下致死时间比值。发酵工程发酵工业的无菌技术第60页各种微生物对湿热相对热阻微生物相对热阻营养细胞和酵母细菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌体1.03×1062~101~5发酵工程发酵工业的无菌技术第61页2.微生物热死定律——对数残留定律试验证实，在一定温度下，微生物营养细胞均相热死动力学符合化学反应一级反应动力学，即：对微生物进行湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡速率与残余微生物数量成正比，这就是对数残留定律。式中，N：任一时刻活细菌浓度（个/L）;t：时间（min）;K：比热死速率常数（min-1）.发酵工程发酵工业的无菌技术第62页

若开始灭菌（t=0）时，培养基中活微生物数为N0t=2.303logN0/N/k-dN/dt=NlnN/N0=-t积分2.303logN0/N=tor可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和k值发酵工程发酵工业的无菌技术第63页例：

有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需灭菌时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)N=0.001;=1.8(min－1)

=2.303

lgN0N=2.3031.8lg(8×1015)=20.34(min)发酵工程发酵工业的无菌技术第64页大肠杆菌在不一样温度下残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不一样温度下死亡曲线发酵工程发酵工业的无菌技术第65页当Nt=0时，t=∞，既无意义，也不可能。普通采取Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。发酵工程发酵工业的无菌技术第66页试验还证实，细菌孢子热杀灭动力学与营养细胞有所不一样。它表现为非对数死亡动力学。这可能与孢子壁化学成份及结构相关。但当温度超出120°C时，热阻极强嗜热脂肪芽孢杆菌孢子热杀灭动力学也靠近对数死亡动力学即符合一级反应规律。发酵工程发酵工业的无菌技术第67页

2灭菌温度和时间选择

培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中C：对热不稳定物质浓度；k’：分解速度常数；

k’改变也遵照阿累尼乌斯方程：

都与对应活化能及T相关发酵工程发酵工业的无菌技术第68页当T1→T2㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1(∵ΔE>ΔE’)∴伴随T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成份分解速率增加倍数，故普通选择高温快速灭菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第69页受热物质ΔE（J/mol）维生素B12维生素B1盐酸盐嗜热脂肪芽孢杆菌孢子肉毒梭菌孢子枯草杆菌孢子9623292048283257343088317984发酵工程发酵工业的无菌技术第70页灭菌温度（˚C）抵达灭菌程度时间（min）维生素B1损失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏影响。发酵工程发酵工业的无菌技术第71页3.影响培养基灭菌其它原因培养基成份油脂、糖类及一定浓度蛋白质、高浓度有机物等增加微生物耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，伴随浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物耐热性。发酵工程发酵工业的无菌技术第72页pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热；pH<6.0，H+易渗透微生物细胞内，改变细胞生理反应促使其死亡。培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。发酵工程发酵工业的无菌技术第73页

温度孢子数灭菌时间(min)(℃)(个/ml)pH=6.15.35.04.74.51201000087533

11510000252516131311010000706535302410010000740720180150150

pH对灭菌时间影响发酵工程发酵工业的无菌技术第74页培养基中颗粒物质培养基中颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌轻易。普通说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，尤其是存在凝结成团胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。发酵工程发酵工业的无菌技术第75页泡沫：泡沫中空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少许消泡剂。微生物数量：浓度越高，所需灭菌时间越长发酵工程发酵工业的无菌技术第76页比如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105℃湿热灭菌时芽孢杆菌数/ml时间(min)9×108489×106369×104209×10214

发酵工程发酵工业的无菌技术第77页分批灭菌培养基分批灭菌就是将配制好培养基放在发酵罐或其它容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌操作过程，也称实罐灭菌。在工业上，培养基分批灭菌无需专门灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低（0.2-0.3Mpa表压），但因其灭菌温度低、时间长而对培养基成份破坏大，对操作难于实现自动控制。发酵工程发酵工业的无菌技术第78页培养基分批灭菌过程中温度改变情况24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温过程包含：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌贡献：

20%、75%、5%。发酵工程发酵工业的无菌技术第79页分批灭菌方法（试验室种子培养基）手提式灭菌锅结构示意图发酵工程发酵工业的无菌技术第80页立式发酵工程发酵工业的无菌技术第81页台式卧式发酵工程发酵工业的无菌技术第82页发酵工程发酵工业的无菌技术第83页发酵工程发酵工业的无菌技术第84页操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基温度降低到接种温度。发酵工程发酵工业的无菌技术第85页分空气过滤器灭菌并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压靠近空气压力向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度发酵工程发酵工业的无菌技术第86页1）培养基预热灭菌时培养基需经过夹套或蛇管先加热到80－90℃，然后再导入蒸汽升温至120－130℃。预热目标一是预防直接导入蒸汽时因为培养基与蒸汽温差过大而产生大量冷凝水使培养基稀释；二是预防直接导入蒸汽所造成泡沫急剧上升而引发物料外溢。发酵工程发酵工业的无菌技术第87页2）培养基灭菌将蒸汽从进气口、排料口或取样口直接导入罐内，使罐温上升至120－130℃，并保温30min。3）降温关闭蒸汽，通冷却水进行冷却，当罐内温度降至70℃以下时，开启搅拌桨搅拌，慢速搅动培养基，加速冷却。发酵工程发酵工业的无菌技术第88页当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐罐压将快速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须间隙开启进气阀，让无菌空气进入发酵罐内，并使罐压保持在0.03-0.05MPa之间，维持降温过程中正压。应该指出，在分批灭菌时，升温阶段对灭菌亦是有贡献。

发酵工程发酵工业的无菌技术第89页温度随灭菌时间改变发酵工程发酵工业的无菌技术第90页升温、冷却两阶段也有一定灭菌效果，考虑到灭菌可靠性主要在保温阶段进行，故能够简单地利用式

㏑(N/N0)=-kt

来粗略估算灭菌所需时间。2.

灭菌时间估算发酵工程发酵工业的无菌技术第91页确保间歇灭菌成功要素（1）内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象（2）压力稳定蒸汽（3）合理操作方法。发酵工程发酵工业的无菌技术第92页培养基连续灭菌

连续灭菌就是将配制好培养基在通入发酵罐时同时进行加热、保温、降温灭菌过程，也称之为连消。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（普通为130-140℃），短时间保温（普通为5-8min）后，被快速冷却，再进入早已灭菌完成发酵罐。组成培养基不一样成份（耐热与不耐热、糖与氮源）可在不一样温度下分开灭菌，以降低培养基受热破坏程度。

发酵工程发酵工业的无菌技术第93页培养基连续灭菌含有对培养基破坏小、能够实现自动控制、提升发酵罐设备利用率、蒸汽用量平稳等优点而被广泛应用，尤其在培养基体积较大时。但对加热蒸汽压力要求较高，普通大于0.45Mpa。同时连续灭菌需要一组附加设备，设备投资大。发酵工程发酵工业的无菌技术第94页连续灭菌（连消）工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程灭菌时间计算

㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]

式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后含菌数。发酵工程发酵工业的无菌技术第95页预热至60-70℃132℃40-50℃维持数分钟

喷淋冷却连续灭菌流程发酵工程发酵工业的无菌技术第96页发酵工程发酵工业的无菌技术第97页例2．某发酵罐内装40m3培养基，采取连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需维持时间。连续灭菌时间估算解：C0=2×105(个/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min发酵工程发酵工业的无菌技术第98页连续灭菌优点：（适合用于大型罐）

可采取高温短时灭菌，营养成份破坏少，有利于提升发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采取板式换热器时，可节约大量能量；适宜采取自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不一样温度下分开灭菌，降低营养成份破坏。发酵工程发酵工业的无菌技术第99页缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，预防灭菌不彻底。

发酵工程发酵工业的无菌技术第100页分批灭菌与连续灭菌比较

灭菌方式

优点

缺点

连续灭菌

1、灭菌温度高，可降低培养基中营养物质损失；

2、操作条件恒定，灭菌质量稳定；

3、易于实现管道化和自控操作；

4、防止了重复加热和冷却，提升了热利用率；

5、发酵设备利用率高；

1、对设备要求高，需另外设置加热冷却装置；

2、操作较麻烦；

3、染菌机会多；

4、不适合于含大量固体物料灭菌；

5、对蒸汽要求高；

分批灭菌

1、设备要求低，不需另外加热冷却装置；

2、操作要求低，适于手动操作；

3、适合于小批量生产规模；

4、适合于含有大量固体物质培养基灭菌；

1、培养基营养物质损失较多，灭菌后培养基质量下降；

2、需进行重复加热和冷却，能耗较高；

3、不适合于大规模生产过程灭菌；

4、发酵罐利用率较低；

发酵工程发酵工业的无菌技术第101页发酵培养基及设备管道灭菌技术空消及管道灭菌空气过滤器灭菌种子培养基实消发酵培养基实消发酵培养基连续灭菌补料实罐灭菌发酵工程发酵工业的无菌技术第102页空气除菌

好气性发酵过程中需要大量无菌空气，空气要作到绝对无菌在当前是不可能，也是不经济。发酵对无菌空气要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌而造成损失即可。在工程设计中普通要求1000次使用周期中只允许有一个菌经过，即经过滤后空气无菌程度为N=10-3

发酵工程发酵工业的无菌技术第103页1、空气除菌方法：

辐射杀菌：利用高能量电磁辐射与菌体核酸光化学反应造成菌体死亡。

加热杀菌

：基于加热后微生物体内蛋白质（酶）热变性而得以实现。静电除菌：利用静电引力来吸附带电粒子而到达除尘灭菌目标。

过滤除菌：利用微生物不能透过滤膜除菌。发酵工程发酵工业的无菌技术第104页2、过滤除菌

过滤除菌是采取定时灭菌介质（棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机或无机烧结材料）来截留空气中微生物而制得无菌压缩空气。从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，当前仍以介质过滤法很好，也是大多数发酵厂广泛采取方法。发酵工程发酵工业的无菌技术第105页按过滤机制不一样绝对过滤利用微孔滤膜，其孔隙小于0.5甚至0.1μm，将空气中细菌滤除，从而取得无菌空气。

深层介质过滤由各种介质组成过滤层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从而取得无菌空气。发酵工程发酵工业的无菌技术第106页空气过滤介质棉花玻璃纤维活性炭超细玻璃纤维纸石棉滤板烧结材料过滤介质新型过滤介质

发酵工程发酵工业的无菌技术第107页1.棉花：品种不一样，要求新鲜，纤维长而疏松，贮存时间长话，纤维易断，易堵塞。2．玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。阻力损失小3．活性炭：强度高，表面积大，空隙大，阻力小，只有棉花阻力1/12。缺点：体积大，装填费时费劲，松紧度不易掌握，空气压降大。发酵工程发酵工业的无菌技术第108页4．超细玻璃纤维纸：

超细玻璃纤维纸是上好无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，再以造纸法做成。该过滤为高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但超细玻璃纤维纸强度小，易断，多用于过滤器。

为了增加强度，可添加：①

木浆纤维。但效率较低；②

环氧树脂；③

多层复合使用。可增加强度，厚度0.25mm。发酵工程发酵工业的无菌技术第109页

．5.石棉滤板：20％石棉，80％其它纤维，厚度3～5mm，纤维短，df粗，效率高。

特点：不怕水，受潮不易穿孔和折断。发酵工程发酵工业的无菌技术第110页过滤器结构（1）深层棉花（活性炭、玻璃纤维）过滤器深层棉花过滤器是立式圆筒形，内部充填过滤介质，空气由下向上经过过滤介质，以到达除菌目标。发酵工程发酵工业的无菌技术第111页填充物按以下次序安装：金属丝网和麻布作用是使空气均匀进入棉花滤层。在充填介质区间过滤器圆筒外部有装夹套，作用为在消毒时对过滤介质加热，要十分小心控制，温度过高轻易使棉花焦化而局部丧失过滤效率，甚至有烧焦着火危险。空气普通从下部圆筒切线方向通入，从上部圆筒排出，出口不宜安装在顶盖，以免检修时拆装管道困难。孔板——铁丝网——麻布——棉花——麻布——活性炭——麻布——棉花——麻布——铁丝网——孔板发酵工程发酵工业的无菌技术第112页过滤器上方装有安全阀、压力表，罐底装有排污孔，方便经常检验空气冷却是否完全，过滤介质是否潮湿等情况。安装介质要求紧密均匀，压紧要一致。弹簧压紧装置能够保持在一定位移范围内对孔板一定压力。发酵工程发酵工业的无菌技术第113页（2）平板式纤维纸分过滤器空气从筒身中部切线方向进入，空气中水雾沉入筒底，由排污管排出，空气经缓冲层经过下孔板经薄层介质过滤后，从上孔板进入顶盖排气孔排出。金属丝网和麻布作用仍是使空气均匀进入滤层。发酵工程发酵工业的无菌技术第114页（3）管式过滤器（4）接迭式低速过滤器发酵工程发酵工业的无菌技术第115页发酵工程发酵工业的无菌技术第116页发酵生产中制备无菌空气大致过程

发酵工程发酵工业的无菌技术第117页空气除菌流程分析这是一个比较完善空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分分离油水，使空气到达较低相对适度下进入过