化学发光免疫分析技术讲义专家讲座

化学发光免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第1页Contents化学发光免疫基本概念

化学发光剂和标识技术化学发光免疫分析类型123电化学发光免疫4化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第2页化学发光免疫基本概念

1化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第3页1.1化学发光基本原理发光：是指分子或原子中电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子过程。依据形成激发态分子能量起源不一样可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。生物发光本质是化学发光化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第4页化学发光原理：伴随化学反应光发射现象

一些物质在进行化学反应过程中，因为吸收了反应产生化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长光，这种吸收化学能使分子发光过程称为化学发光(Chemiluminescence，CL)

。

1.1化学发光基本原理化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第5页化学发光分析依据化学发光反应在某一时刻发光强度或反应发光总量来确定反应中对应组分含量分析方法，称为化学发光分析。化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第6页化学发光分析优点化学发光含有荧光特异性，同时不需要激发光，就防止了荧光分析中激发光杂散光影响有很高灵敏度，而且不象放射分析那样存在强烈环境污染和健康危害，是一个非常优异定量分析方法。化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第7页化学发光分析缺点即使化学发光具备很高特异性和很小干扰，但化学分析本身不特异性，制约了整个方法使用。化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第8页化学发光免疫分析

Chemiluminescenceimmunoassay(CLIA)化学发光免疫学

特异性强

敏感性高

简便、快速

重复性好化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第9页1.2化学发光种类直接化学发光一些化学反应能释放足够能量把参加反应物质激发到能发射光电子激发态，若被激发是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述以下：A+B

C*+DC*

C+h

1化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第10页1.2化学发光种类间接化学反应发光

若激发能传递到另一个未参加化学反应分子F上，使F分子激发到电子激发态，F分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示以下：

A+B

C*+DC*+F

F*+CF*

F+h2化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第11页化学发光效率决定于生成激发态产物分子化学激发效率（φCE）和激发态分子发射效率（φEM）。化学发光反应发光效率、光辐射能量大小以及光谱范围，完全由发光物质性质所决定，每一个发光反应都含有其特征性化学发光光谱和不一样化学发光效率。1.3化学发光效率化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第12页化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第13页

化学发光剂和标识技术2化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第14页2.1化学发光剂概念在化学发光反应中参加能量转移并最终以发射光子形式释放能量化合物，称为化学发光剂或发光底物。化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第15页

化学发光剂选择条件：①发光量子产率高；②物理-化学特征要与被标识或测定物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应结果；⑤在所使用浓度范围内对生物体没有毒性。化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第16页直接化学发光剂

直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶催化作用，直接参加发光反应，它们在化学结构上有产生发光特有基团，可直接标识抗原或抗体。

2.2化学发光剂种类直接化学发光剂，间接化学发光剂化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第17页A.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm光，含有很高发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系发光体。

化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第18页

代表性物质：光泽精(lucigenin)氧化剂：H2O2还原剂：乳酸尿酸抗坏血酸催化剂：过渡金属离子、酶抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用间接测定：能够生成H2O2基质及对应酶

max=445nm量子产率高，易于标识，是发展化学发光免疫分析和DNA发光探针主要标识物化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第19页B.三联吡啶钌

三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第20页酶促反应发光剂：利用标识酶催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光发光剂称为酶促反应发光剂。A．鲁米诺及其衍生物

B．AMPPD间接化学发光剂化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第21页A.鲁米诺及其衍生物鲁米诺发光原理化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第22页B．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第23页A.碳二亚胺（EDC）缩正当

2.3发光剂标识化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第24页B.过碘酸钠氧化法

化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第25页C．重氮盐偶联法化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第26页D.N-羟基琥珀酰亚胺活化法

化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第27页1．发光剂选择

2．被标识蛋白质性质

3．标识方法选择

4．原料比

5．标识率

6．温度2.4影响发光剂标识原因化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第28页化学发光免疫分析类型3化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第29页用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标识抗体(抗原)，与待测标本中对应抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-化学发光剂标识抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、统计单位时间内所产生光子能，这部分光积分与待测抗原量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原含量。3.1直接化学发光免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第30页发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带吖啶酯标识物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）直接化学发光机理（夹心法）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第31页

化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用参加催化某一化学发光反应酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标识抗原或抗体，在与待测标本中对应抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标识抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物浓度。3.2化学发光酶免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第32页该分析系统采取辣根过氧化物酶（HRP）标识抗体(或抗原)，在与反应体系中待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标识抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。3.2.1辣根过氧化物酶标识化学发光免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第33页辣根过氧化物酶标识化学发光免疫分析示意图

3.2.1辣根过氧化物酶标识化学发光免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第34页该分析系统以碱性磷酸酶标识抗体(或抗原)，在与反应体系中待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标识抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

3.2.2碱性磷酸酶标识化学发光免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第35页碱性磷酸酶标识化学发光免疫分析示意图

3.2.2碱性磷酸酶标识化学发光免疫分析化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第36页分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育，使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号产生信号检测化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第37页电化学发光免疫4FlowcellFeOxidizedReduced化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第38页Electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA20世纪80年代出现，90年代用于临床检测。ECLIA电化学免疫学化学发光发光特点：联吡啶钌（标识物+三丙胺自由基（催化）+三角形脉冲电压（激发），0.01ms就可发出稳定光。优点：1.灵敏度高（联吡啶钌再循环），2.检测步骤简化（游离/结合）3.可实现多元检测4.可实现自动化化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第39页在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标识Ab，经过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，依据三联吡啶钌在电极上发出光强度对待测Ag或Ab进行定量/定性。电化学发光免疫分析Electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA原理电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁珠技术化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第40页电化学发光剂定义：指经过在电极表面进行电化学反应而发出光物质。特点反应在电极进行化学发光剂：三联毗啶钌电子供体为：三丙胺（TPA）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第41页ECL分析中采取[Ru(bpy)3]2+作为标识物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀酸胺酯（NHS），该衍生物含有水溶性，且高度稳定，确保电化学发光反应高效和稳定，而且防止了本底噪声干扰。三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+

特点化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第42页[Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合分子比超出20仍不会影响抗体可溶性和免疫活性；[Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小，即便小分子核酸也能标识，使检测样品种类大大丰富，更主要是为其检测样品种类开发前景提供了辽阔空间。三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+

特点化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第43页1电化学反应2化学发光3循环+ECLIA原理化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第44页惯用方法类型固相磁性微球吸附采取固相载体是带有磁性直径约2.8μm聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀悬液，参加反应时类似液相，反应速度大大加紧；链霉亲和素-生物素吸附

“链霉亲和素-生物素”是是含有很强非共价相互作用一对化合物，含有牢靠而特异结合，应用此放大系统，使检测灵敏度大大提升亲和素—糖蛋白；生物素-维生素H化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第45页ECLIA检测流程图一（双抗体夹心形成）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第46页ECLIA检测流程图二（生物素与亲和素结合）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第47页ECLIA体系结构图化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第48页ECLIA检测流程图三（磁珠吸引吸附于电极表面）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第49页ECLIA检测流程图四（电极充电开启电化学反应）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第50页ECLIA检测流程图五（撤消磁场冲洗磁珠）化学发光免疫分析技术讲义专家讲座第51页电化学发光免疫测定示意图化学发光免疫分析技