诃子水煎液对小鼠肝毒性的量-时-毒关系研究

诃子水煎液对小鼠肝毒性的量-时-毒关系研究

中药补丸是将君主科植物的祭品（交换）或从君主科的角度收集和成熟的果实。材料表面1.动物方法1.瑶子水提取物的制备结果1.大鼠急性毒性和ld50的测定结果在本研究条件下,Bliss软件计算诃子水煎液小鼠口服半数致死量LD2.大鼠单次给药肝脏毒性“剂量-毒”关系的研究2.1影响大鼠血清中ran和ast的影响2.2小鼠肝脏损伤光镜下,空白组肝小叶结构清晰完好,肝细胞未见明显变形,坏死,肝窦未见明显瘀血扩张;诃子水煎液16、12、9g/kg组小鼠肝脏出现细胞核浓缩、细胞肿胀,并且具有剂量依赖性。诃子水煎液8、6g/kg组小鼠肝脏未出现明显细胞坏死。3.大鼠单次给药肝脏毒性“时间毒性”关系的研究3.1回收溶液对大鼠的体重减轻有影响3.3小鼠血清alt值的变化,有以下基因组化的差异诃子水煎液9g/kg组小鼠在给药后1-24h内,血清中的ALT值均有不同程度的升高,尤其在给药后1、2、6、24h时与空白组比较,差异显著(P<0.01);且在给药后24h,小鼠血清ALT值突然急剧升高,出现个体差异性。其AST值在给药后1-24h内,均有不同程度的升高,尤其在给药后1、2、6、24h时与空白组比较,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01);且在给药后24h,小鼠AST值突然急剧升高,出现个体差异性。4.回收溶液9g。kg。血液中每一个时间点的肝脏组织病理学变化身份酶活性检测在《中华人民共和国药典》中,诃子被描述为无毒性中药,而且目前关于诃子的研究都集中在成分的药理作用上,对其毒性研究开展较少。为指导正确的临床用药,我们有必要针对它的毒性展开更多的研究。本研究结果显示,诃子水煎液的LD血清生化指标可以提供药物导致的肝脏病理性损伤很多有用的信息,因此,它们的测量是临床诊断中有效的手段之一。血清ALT、AST是反应肝脏损伤的敏感并且主要的指标。一般情况下,血清中的ALT与AST水平会保持动态平衡。一旦肝脏出现损伤,即使是1%肝细胞受到损害,血清中ALT与AST酶的活力水平就会出现显著升高,因此,ALT与AST为反映肝功能是否正常的敏感指标。针对目前诃子肝毒性研究内容较少,本实验通过检测小鼠灌胃不同剂量的诃子水煎液后不同时间点血清中的ALT和AST改变,评价诃子水煎液致小鼠肝损伤的“量-毒”和“时-毒”关系。“量-毒”实验结果初步表明,小鼠在单次给予较大剂量的诃子水煎液可使小鼠血清中的ALT与AST值显著性升高,并呈剂量依赖性。病理切片结果显示,较大剂量(9g/kg)服用诃子水煎液后,小鼠肝脏出现细胞核浓缩及细胞肿胀等坏死,而小小剂量(6g/kg)给予小鼠灌胃,肝组织病理形态学未见明显改变变。“时-毒”实验结果初步表明,小鼠单次灌服6.0g/kg诃子水煎煎液后,血清中的ATL及AST出现不同程度的升高,但是在24后后,血清中ALT及AST值恢复到正常水平。小鼠单次灌服9.0g/k诃诃子水煎液后,在1-12h内血清中的ATL及AST出现不同程度的升升高,在24h时,血清中ALT及AST值出现爆发性增长,甚至出现动动物死亡。从研究中,已经发现诃子水煎液具有肝脏毒性作用,但是,诃诃子所致肝脏毒性的机制还没有研究清楚,我们需要更加努力开开展关于诃子及其他有潜在毒性的中草药研究,以指导安全的临临床用药。SPF级ICR小鼠310只,雌雄各半,4周龄,体质量20-22g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001号。饲养于北京市药品检验所GMP实验室,温度为(22±2)℃,相对湿度为(50±2)%。2.测定试剂与仪器诃子,由北京中卫饮片厂提供,经北京市药品检验所中药室陈友根老师鉴定为使君子科植物诃子(TerminaliachebulaRetz.)的干燥成熟果实,产地为云南。谷草转氨酶(aspartatetransaminase,AST)测定试剂盒(批号:140531)、谷氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)测定试剂盒(批号:140601)均购自中生北控生物科技股份有限公司。OLYMPUSAU400生化仪、5430R台式高速冷冻离心机购自中生北控生物科技股份有限公司。取诃子,捣烂,去核,取诃子肉,加适量蒸馏水浸泡30min,大火煮沸,小火煎煮30min,重复1次,将两次药液合并,滤过,浓缩,得到诃子水煎液。临用时用蒸馏水将诃子水煎原液配制成不同浓度药液。2.急性毒性试验参照文献[3]的方法,取ICR小鼠70只,按体质量区间随机分成7组:空白组和诃子水煎液不同浓度给药组。每组10只,雌雄各半。在预试基础上,设组间剂量比为1∶0.85,诃子水煎液剂量分15.6、3.2、9.6、8.0、6.8、5.6g生药/kg体质量。实验前各组小鼠禁食不禁水12h,各给药组小鼠分别一次性口服灌胃不同浓度诃子水煎液,空白组小鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液,给药量按40mL/kg体质量。各组灌胃给药后,当天连续观察6h,之后每天观察1次,连续观察14d,记录各组小鼠毒性症状,死亡数量和死亡时间。若有小鼠死亡,则将死亡小鼠解剖,肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠等脏器的改变,将心、肝、脾、肺、肾等主要脏器取出,固定,进行病理观察。第14天观察结束后,所有存活小鼠用4%水合氯醛溶液麻醉(20mL/kg),打开腹腔,肉眼观察肉眼观察各脏器的改变。肉眼观察结束后,将各主要脏器置入10%福尔马林溶液固定液中固定,进行常规病理修块,脱水,包埋,切片和HE染色,400倍显微镜下进行病理组织学检查。3.alt和ast浓度测定取ICR小鼠60只,按体质量区间随机分成6组,即空白组和诃子水煎液5个剂量给药组,每组10只,雌雄各半。按20mL/kg体质量灌胃1次,空白组给予0.9%氯化钠溶液,诃子水煎液各剂量组分别灌服16.0、12.0、9.0、8.0、6.0g生药/kg体质量诃子水煎液。24h后,对小鼠进行麻醉处理并且进行腹主静脉取血收集0.5-1.0mL血液至离心管,2500r/min转速下离心15min,取上层血清,利用自动生化分析仪测定血清中ALT、AST的浓度。摘取小鼠肝脏进行常规HE染色,200倍显微镜下进行病理组织学检查。4.小鼠分组及处理参照文献[4]的方法,取ICR小鼠180只,雌雄各半,随机分为3组,即空白组和诃子水煎液2个剂量组。各组小鼠依据处理时间依次分为1、2、4、6、12、24h组。按20mL/kg体质量灌胃1次,空白组给予0.9%氯化钠溶液,诃子水煎液各剂量组分别灌服9.0、6.0g生药/kg体质量的诃子水煎液。于相应时间点称量小鼠体质量,按方法“3.”测定血清中的ALT、AST浓度,计算脏器指数及肝脏组织病理学观察。5.对小鼠肝胰腺相关指标的影响实验数据用ue0af±s表示,采用SPSS17.0统计软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义。并用Bliss软件计算LD见表1。口服给药后0.5h,小鼠出现竖毛、不活泼、软便等症状。连续观察6h,未见其他毒性症状出现。给药后24h,部分动物出现嗜睡、消瘦、步态不稳等症状,并且最大剂量组出现动物死亡。动物死亡前均出现呼吸困难、惊厥、抽搐等症状,死亡时间主要集中在给药后24-72h内。对死亡动物立即解剖,可见肝脏出现明显异常,其余脏器未见明显异常。见表2。灌胃给予小鼠诃子水煎液24h后,与空白组比较,诃子水煎液16、12、9g/kg组小鼠血清ALT、AST明显升高(P<0.01);诃子水煎液8.0g/kg组小鼠血清ALT显著升高(P<0.01),而AST无显著性差异。诃子水煎液6.0g/kg组ALT、AST与空白组相比无显著性差异。见图1。肉眼观察小鼠肝脏,空白组小鼠的肝脏呈红褐色,质地光滑湿润,富有弹性。高剂量(16.0、12.0、9.0g/kg)组小鼠肝脏呈现出一定的灰黄色,没有光泽,在肝脏表面能观察到大片灰白色坏死病灶。见表3。给药后1-12h,诃子水煎液9g/kg组小鼠较空白组组小鼠无明显差异,给药后24h,小鼠体质量降低,较空白组差异显著(P<0.01)。诃子水煎液6g/kg组小鼠在给药后4h时,较空白组有明显差异(P<0.01)。3.2对小鼠血清中ast、alt值的影响见表4。给药后2h,诃子水煎液9g/kg组小鼠出现肝脏系数降低,且之后各时间点与空白组比较,差异显著(P<0.05,P<0.01),其中,12h肝脏系数降到最低值。诃子水煎液6g/kg组小鼠的肝脏系数与空白组比较,无显著性差异。见表5-表6。诃子水煎液6g/kg组小鼠在给药后1-12h内,血清中的ALT值均有不同程度的升高,在给药后2h时达到峰值,与空白组同期比较,差异显著(P<0.01);在给药24h后,小鼠血清中ALT恢复到正常值,与空白组比较,差异无统计学意义。其AST值在给药后1-6h内,均有不同程度的升高,在给药