贻贝中麻痹性贝类毒素的测定

贻贝中麻痹性贝类毒素的测定

麻痹性核糖（psp）是神经麻痹性核糖中毒的毒性药物。它可以通过多种淡水蓝细菌和海上红景天藻类合成。这是一种由四环芳烃组成的三级化合物。这是最常见的海生动物之一。超过一半的外壳含量。细菌回复突变试验主要用于检测受试物对微生物的基因突变作用,预测其遗传毒性和潜在的致癌作用。为了对福建省近海地区麻痹性贝类毒素的具体情况做进一步的了解,2017年6月作者从漳州沿海一个食用污染毒麻痹性贝毒的贻贝(Mytilusedulis)引起食物中毒的区域,采集了4份贻贝样品。本研究先采用小鼠生物法定量分析这几份贻贝提取物中麻痹性贝类毒素的含量,从中筛选出合适的含麻痹性贝类毒素的样本,再应用细菌回复突变试验方法对麻痹性贝类毒素的致突变效应进行研究,对其致突变作用和潜在危害做出初步评估,以期为沿海贝类毒素的风险评估、确保食用安全提供参考依据。1材料和方法1.1测试对象1.2动物清洁级雄性ICR小鼠50只,19～21g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2017-0005。1.3鉴定试剂及仪器菌株:组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TA102、TA100、TA98、TA97菌株4株(由复旦大学公共卫生学院提供),经鉴定合格;试剂:0.1mol/L氢氧化钠溶液、0.18mol/L盐酸溶液、5mol/L盐酸溶液等,使用前均经103MPa20min高压灭菌。阳性物:0.2μg/皿2,4,7-TNFone、1.5μg/皿NaN1.4微生物常用接种工具、自动菌落计数仪、BSC-1360ⅡA2生物安全柜、电子天平、SS-325型自动高压灭菌器、SHP-250生化培养箱、离心机、DK-S28电热恒温水温箱、培养皿等。1.5方法1.5.1贝肉ph值的测定方法依据食品安全国家标准“贝类中麻痹性贝类毒素的测定”GB5009.213-2016的要求,将4份贻贝分别用蒸馏水清洗干净,切断闭壳肌,开壳收集贝肉,将贝肉放在筛子中用蒸馏水反复沥洗过滤,均质后各自称取50g试样,置于烧杯中,加入0.18mol/L盐酸溶液(将15.5mL盐酸用蒸馏水稀释至1L)50ml充分搅拌,逐滴加入5mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液将pH值调至4.0。将混合物加热煮沸5min,冷却至室温,移至量筒中并用0.18mol/L盐酸溶液稀释至100ml,再次调pH值至4.0,经10000r/min离心5min,收集上清液备用。1.5.2对小鼠的毒力将所购买的小鼠放本实验室检疫4d后,每个受试物提取液各选用3只小鼠,称重并记录重量。对每只小鼠腹腔注射1ml提取原液,及时记录注射的时间和小鼠死亡时间。中位数死亡时间小于5min的,对提取原液进行适当稀释,再选取3只小鼠进行试验,直至得到中位数死亡时间落在5～7min内为止;若所有的小鼠在15min内都没有死亡,就直接报告鼠单位毒力小于400MU/100g。由所得的3只小鼠的致死时间求出中间值,查“小鼠死亡时间与鼠单位的关系表”、“小鼠体重校正系数表”算出经校正后的小鼠单位中间值,再乘以提取液的提取比,得出相当于100g受试物的麻痹性贝类毒素的小鼠单位。同时另取3只小鼠,每只腹腔注射1ml0.18mol/L盐酸溶液作为溶剂对照。1.5.3酸环境选择试验预先将底层、顶层培养基的pH值调到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5,分别接种上4种不同的测试菌株,置37℃培养48h后,观察各菌株在不同酸碱环境下的生长菌落数,从中选择出合适的pH值作为菌株培养的酸环境。1.5.4细菌回复突变试验采用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统,以2,4,7-TNFone、NaN2结果2.1小鼠的死亡时间测定aA提取原液注射的3只小鼠,在约50s后都出现步态不稳、转圈、抽搐、呼吸困难、两条后腿僵直等中毒症状,先后在注射后1～2min内呼吸停止死亡。按倍数关系依次稀释A提取液后再注射给予小鼠,观察记录死亡时间。最后A提取原液在稀释到32倍时,小鼠的中位数死亡时间分别为6min16s、5min27s、6min44s,均落在5～7min内。B、C、D3份提取原液及0.18mol/L盐酸对照液经腹腔注射给予小鼠后,所有小鼠在15min内均未死亡,也无明显的中毒症状,结果见表1。2.2培养基的生长环境根据对培养基pH值环境的筛选,发现pH值在5.0以下的培养基均无法凝固成型,pH值6.0及以上的培养基可以正常凝固,而且各测试菌株在pH值6.0～7.5间生长的菌落数无明显差异,所以选定pH=6为菌株培养的酸环境。2.3回复突变菌落数测定根据对小鼠生物法测定结果的筛选,本研究选定其中小鼠毒力单位最高的A份贻贝进行细菌回复突变试验;在背景生长良好的条件下,0.16～100mg/皿5个剂量受试物同时在有或没有代谢活化系统(-S9或+S9)2种不同测试环境中,对4种测试菌株诱发的回复突变菌落数与未处理对照组、溶剂对照组相比,均未有剂量-反应关系,也无明显的倍数增加,各阳性对照菌落回复突变数均大于未处理对照组的2倍以上,未处理对照组与溶剂对照组相比,无显著性改变。结果表明:每100g毒力单位为10151.68的贝肉,在0.16～100mg/皿的浓度范围内,未发现能对组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌的基因组诱发突变作用,检测结果见表2。3细胞变异常基因突变是很重要又很普遍的生物学现象,某些物理、化学、生物因素都可以诱导细菌发生诱发性突变,突变涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失问题,凡能致使细菌发生变异的物质常常也能够诱导人体细胞发生变异。TA97、TA98、TA100、TA102菌株常用于检测化学物质的基因突变刘洁生等人曾从染毒贝类中提取并检测出PSP含量(1MU毒素相当于0.18μgSTX),连续35d给予大鼠0.46～1.84μgSTX/100g剂量的PSP,观察