微生物分离纯化技术 课件

4.3微生物分离纯化技术学习导航1.了解常用的微生物分离纯化的方法和步骤2.学会平板分离微生物的方法(重点)3.培养无菌意识（重点）是将需要的某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来，得到只含有一种微生物的培养物。是由一个单细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称纯培养。菌种的分离微生物的纯培养

一、基本概念分离技术主要是稀释和选择培养。稀释：是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线法和稀释涂布法。选择培养：如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。概念

获得纯培养的方法：

平板划线分离法12单细胞挑取法3组织分离法4选择培养基分离5一、菌种的分离方法稀释平板分离法1.平板划线分离法

用无菌接种环挑取待分离材料，在平板培养基表面划线稀释而获得单菌落的方法。目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以获得纯菌。方法

分区划线法：适用于含菌量较多的标本

连续划线法：适用于含菌量较少的标本菌落当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。2.稀释平板分离法：

将待分离样品做系列稀释，使样品中的微生物细胞充分分散。取合适稀释度的样品与培养基混合，培养出现菌落。如稀释度适合在培养基平板上即可出现的单个菌落。(1)稀释倾注法（2）稀释涂布法（1）稀释倾注平板法（pourplatemethod）

先将待分离的材料用无菌水作一系列的梯度稀释（如1∶10、1∶100、1∶1000…）充分混匀依次1mL，注意更换移液管然后分别取不同稀释度的菌悬液0.2（1.0）ml与已灭菌的培养皿中，倾入灭过菌的已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基，摇匀后，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可看出菌落如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的倾注平板（2）稀释涂布法梯度稀释操作：依次1mL，注意更换移液管充分混匀梯度稀释1个225mL无菌水2个9ml无菌水得10-125g或25mL样品10-2,10-3的菌悬液1ml倒平板，待平板冷却凝固后再加样取菌悬液（0.1mL）2.稀释涂布法将菌液均匀涂布分散倒置培养恒温培养3、单细胞挑取法用显微挑取器，从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的方法。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适于较大微生物显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。4、组织分离法分离步骤⑴制作培养基并对培养基灭菌。⑵对组织块进行消毒处理：在无菌条件下，用无菌刀片切取小块受病组织，放入0.1%的升汞水中浸泡2-3min，再用无菌水冲洗数次。是用感病的生物体组织来分离微生物得到纯培养物的方法。⑶接种：把组织块分割成小块，放到平板培养基表面。每个平皿中放入3-5个小组织块⑷培养:适温培养到组织块周围长出单菌落⑸转管纯化：将需要的单菌落转接到斜面试管培养基上，经培养后得到纯培养物。此种方法适合于病原微生物的分离。5.选择培养分离法使待分离微生物生长特征“突出”；抑制大多数其它微生物的生长；使待分离微生物生长更快。微生物群落中数量占少数的微生物得到分离纯化：颜色反应：分离特定的菌株牛奶平板：分离蛋白酶产生菌使待分离微生物生长特征“突出”高温下培养：分离嗜热细菌培养基中不含N：分离固氮菌培养基加抗生素：分离抗性菌抑制大多数其它微生物的生长富集培养:

利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，仅使待分离微生物旺盛生长，在群落中的数量大大增加，从而更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。使待分离微生物生长更快。几种分离方法的应