骨髓间充质干细胞经股骨输注的研究进展

骨髓间充质干细胞经股骨输注的研究进展

0细胞间充质干细胞的体内转归骨髓间充质干细胞（bmsc）能分泌大量生物活性物质，如免疫调节、抗炎、抗死亡、血管生成和生长元素。目前,关于骨髓间充质干细胞的体内转归研究多是建立在静脉传输途径的基础之上。Gao等为此,实验采用经静脉和股骨两种途径输注骨髓间充质干细胞的小鼠模型,通过生物发光法、病理切片、流式细胞仪、荧光定量PCR法观察骨髓间充质干细胞经不同途径输注后细胞在小鼠体内的迁移、分布等特征。通过实验结果的整理、分析,观察骨髓腔、尾静脉注射这2种方式对间充质干细胞体内细胞的迁移和定位分布的影响,探讨经股骨输注骨髓间充质干细胞能否促进细胞归巢至骨髓。1材料和方法1.1项目设计1.2时间和地点1.3动物及转染物红色荧光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)转基因骨髓间充质干细胞(RFP-BMSCs)细胞株及HEK293T细胞株购买于广州赛业科技有限公司。健康清洁级雄性10周龄BALB/c小鼠6只,体质量18-19g,购自南方医科大学实验动物中心,动物许可证号:SCXK(粤)2013-0034。健康雄性10周龄绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因C57BL/6小鼠12只,清洁级,体质量18-19g,购自南京大学生物研究所。实验前均在南方医院无特定病原体饲养间适应性饲养1周。实验小鼠鼠符合卫生部一级动物标准,并经过动物伦理学委员会批准。1.4实验方法1.4.1uc-rfp-bmscsb的制备方法制备带有新霉素耐药基因-荧光素酶基因(NeoR-Luc)的慢病毒转染质粒(美国GeneCopoeia),制备病毒,再导入RFP-BMSCs中,最后得到NeoR-Luc-RFP-BMSCs。具体为:使用慢病毒制备方法:将慢病毒骨架载体NeoR-Luc质粒和包装质粒(美国GeneCopoeia)共转染到HEK293T细胞中,在37℃的恒温箱中培养,收集此后48h和72h之间富含慢病毒的培养基上清液。以含Neor-Luc基因的慢病毒上清液与RFP-BMSCs转染8h,转染体系中聚凝胺终浓度为4mg/L。转染48h后,在接种RFP-BMSCs的培养基中加入1g/L的新霉素类似物G418(美国Invitrogen公司),培养14d后可获得NeoR-luc-RFP-BMSCs。1.4.2工作液的配制准备100mmol/L荧光素底物(艾美捷科技有限公司)原液加入到无菌水中(100×稀释),充分混匀,制备为工作液(1mmol/L),现配现用,-20℃避光保存。准备质量浓度15g/L的荧光素底物工作液,即15mg的荧光素底物加入到1mL的PBS(背景博奥森生物技术有限公司)(不含Mg1.4.3小鼠骨髓间充质干细胞的制备(1)RFP-BMSCs的培养:将RFP-BMSCs从液氮罐中取出,放入含有体积分数10%FBS的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基(广州赛业科技有限公司)中,在37℃、含有体积分数5%CO1.4.4细胞外加剂用量筛选在96孔细胞培养板里每隔1个孔依次加入等量的PBS和荧光素底物20μL,再分别接种不同数量梯度的NeoR-Luc-RFP-BMSCs(5×101.4.5小鼠骨髓腔中nanor-luc-rfp-bmscs的荧光显像实验取2只BALB/c小鼠,分别游离左、右股骨,将4根股骨分为2组,实验组3根,空白对照组1根。用骨穿针刺入实验组股骨,分别从骨穿针向小鼠骨髓腔中输注不同数量梯度的NeoR-Luc-RFP-BMSCs(2.5×10在小动物活体成像仪中,调节光圈为medium,曝光时间为45s,观察输注不同数量级NeoR-Luc-RFP-BMSCs的实验组股骨中荧光强度的不同。1.4.6小鼠脏器组织病理学检测将6只BALB/c小鼠和12只GFPC57小鼠均随机分为2组,股骨组和尾静脉组(各3只BALB/c和6只GFPC57小鼠)。股骨组:在X射线引导下,使用小鼠骨穿针(课题组专利)穿刺一侧股骨,经骨穿针向小鼠骨髓腔中输注NeoR-Luc-RFP-BMSCs细胞悬液(2.5×10切取两组小鼠各脏器组织(肺、肝、肠横断,脾),用滤纸吸去多余水分,转移到样品托上,OCT包埋剂(美国MolecularProbes公司)后切片,滴少许防荧光猝灭封片剂(背景博奥森生物技术有限公司)于玻片表面,置于共聚焦显微镜(日本Olympus公司)下观察和拍摄。切取两组小鼠肝、脾和肺,研磨,并将穿刺侧股骨中骨髓冲出,收集各脏器和骨髓细胞悬液。然后用70μm细胞筛网(Cat.15-1070,BiologixGroupLtd.,USA)过滤,PBS洗涤后,调整细胞浓度为5×10分离取出两组小鼠不同的脏器,在研钵中将其研磨成单细胞悬液,PBS洗涤后置于1.5mLEP管中,离心后弃去上清,加入1mLTrizol试剂。提取组织和器官RNA,反转录,使用ABI7500PCR仪(AppliedBiosystems,Inc.),按照实时荧光定量PCR试剂盒(SYBRPremixExTaq1.5体外游离股骨中nh-luc-rfp-bmscs的荧光显像实验2.(1)RFP-BMSCs和NeoR-Luc-RFP-BMSCs的细胞形态和生长情况;(2)细胞浓度梯度实验结果;(3)体外游离股骨中NeoR-Luc-RFP-BMSCs的荧光显像结果;(4)不同途径NeoR-Luc-RFP-BMSCs的体内输注实验结果。1.6统计学处理方法采用SPSS18.0软件对采集到的所有数据进行分析,计量资料用ue0af±s表示,两样本均数比较采用t检验,组间数据两两比较用单因素方差分析和SNK法,非正态分布数据用秩和检验比较,P<0.05为差异有显著性意义。2结果的结果2.1动物的数量分析纳入小鼠18只,均进入结果分析,无死亡和感染,最终计入结果分析的数量为18只。2.3细胞浓度梯度试验的结果小动物活体成像仪结果显示:5×102.4在离体行走腿的中间，显示模糊的纳米荧光图像r-luc-rtp-bmsbs通过小动物活体成像仪可见,在实验组,2.5×102.5小鼠双肺荧光注射NeoR-Luc-RFP-BMSCs与荧光素底物混合悬液5min后,在股骨组,荧光首先出现在股骨注射部位,后迅速扩散至双肺;在尾静脉组,可见小鼠双肺处首先出现荧光,且两组小鼠肺部荧光强度无明显差异(图3),15min后双肺荧光强度达到高峰,股骨处荧光逐渐减弱。共聚焦显微镜观察结果显示:细胞输注后1h股骨组和尾静脉组小鼠的肺脏出现大量红色荧光细胞,24h后肝脏、脾脏亦可见红色荧光细胞出现,两组病理切片上红色荧光分布未见明显差异(图4)。在细胞注射后1,24h,两组小鼠肝、脾、肺和骨髓内RFP3进一步降低了小鼠感染的风险关于骨髓间充质干细胞经静脉途径和骨髓腔内途径输入体内后的移行规律红、绿荧光蛋白的发现为生物医学的研究提供了极大的工具便利。在此基础上,红绿荧光蛋白转基因小鼠的模型逐渐建立经股骨途径输注细胞已被很多研究者尝试,国内外许多学者经股骨途径输注细胞时,采用的方法是有创手术法,即剪开皮肤,暴露股骨/胫骨,直视下将针头插入膝关节后输注细胞,最后缝合切口,这种方法虽然可以将细胞输入骨髓腔,可是过程复杂,操作时间长,并且增加了术后感染的风险。实验采用团队自创的股骨注射法(专利号:201620090904.2),不仅可以保证细胞准确输入骨髓腔,而且无创、便利,很大程度上降低了小鼠感染的风险。综上所述,经尾静脉和股骨两种途径输注骨髓间充质干细胞后,细胞在体内的分布无明显差异。经股骨途径输注虽然可以实现靶向注射,但是细胞很难停留在局部,不能增加骨髓间充质干细胞归巢至骨髓的效率,不利于骨髓移植后造血重建及移植物抗宿主病的预防。为了实现骨髓间充质干细胞的靶向移植,更好地发挥其促造血及免疫调节作用,实验下一步将对怎样使骨髓间充质干细胞停留在骨髓或其他脏器局部展开深入的研究。实验设计为第一作者和通讯作者,实验实施为第一、二、四、五、六、七、八作者,实验评估为第二作者和通讯作者,资料收集为第一、二作者。所有作者共同认可文章无相关利益冲突。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相关动物伦理学标准的条例,实验方案中有关动物伦理问题已经南方医科大学南方医院实验动物伦理委员会讨论批准。文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章经国内小同行外审专家双盲外审,符合本刊发稿宗旨。文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁,可接受核查。文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。这是一篇开放获取文章,文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款,在合理引用的情况下,允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展,同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献,并为之建立索引,用作软件的输入数据或其它任何合法用途。细胞学实验。于2015年6月至2015年12月在南方医科大学南方医院完成。实验细胞实验动物以外检查内部实验大鼠腿骨分离注入细胞观察冷冻切片流式细胞培养荧光定量pcr2.2细胞增殖和传代培养(1)RFP-BMSCs:接种6h后部分细胞已经贴壁,接种24h后贴壁细胞呈多角形、短棒形或者圆形。第2天换液后贴壁细胞迅速增殖,呈纺锤形或梭形,部分细胞形成集落,增殖加快,形成大小不等的集落,集落融合成片,折光性强,细胞形态多为纺锤形或者多角形,接种3d时细胞80%-90%融合,铺满瓶底,开始传代。传代培养24h细胞完全贴壁生长,分布均匀,呈梭形,传代至第3代时,细胞形态均一,呈辐射状或者漩