脊髓灰质炎病毒突变体荧光定量pcr方法的建立及验证

脊髓灰质炎病毒突变体荧光定量pcr方法的建立及验证

骨灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科。这三种血液（i、ii和iii）可引起骨灰质炎的发生。自1988年世界卫生组织启动“全球根除脊髓灰质炎行动”以来,脊髓灰质炎病例数减少了99%以上;2013年,世界上仅有尼日利亚、巴基斯坦和阿富汗3个国家仍然有脊髓灰质炎病毒的传播目前,脊髓灰质炎病毒神经毒力的检测方法主要包括猴体神经毒力试验、携带人脊髓灰质炎病毒受体的转基因小鼠(PVRTg21)神经毒力试验、聚合酶链反应和限制性酶裂解突变分析(mutantanalysisbyPCRandrestrictionenzymecleavage,MAPREC)以及深度测序(deepsequence)。上述方法的试验周期长,费用高,技术难度大,对实验室硬件条件要求较高。Troy等1材料和方法1.1病毒和载体脊髓灰质炎病毒Ⅰ型Sabin株、Ⅱ型Sabin株、Ⅲ型Pfizer株,滴度分别为8.625、8.165和8.125LgCCID1.2dna检测和标准WHOMAPRECtype3国际标准品WHO1stInternationalStandardforMAPRECanalysisofpoliovirustype3(Sabin)DNA0.9%472-C(NIBSCcode:95/542)和WHO1stInternationalStandard,ControlDNAforMAPRECanalysisofpoliovirustype3(Sabin)(NIBSCcode:94/790)均购自英国国家生物制品检定所(theNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,NIBSC);TaqmanuniversalPCRmastermixwithoutUNG试剂盒、MagMAX-96ViralRNAisolationkit试剂盒均购自美国LifeTechnologies公司;Primescript1stcDNAsynthesiskit、LAtaq聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;MagMAX1.3引物及探针的设计与合成根据GenBank中登录的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒基因序列(见表1)和文献[2]设计引物及探针,序列见表2,引物探针均由Invitrogen公司合成。1.4质粒的构建根据表1中的参考病毒信息,委托宝生物工程(大连)有限公司合成6个脊髓灰质炎病毒5’UTR基因,并克隆至pMD19-T载体。其中Sabintype1、2、3病毒株为减毒株,根据其基因序列合成并构建的质粒分别命名为非突变质粒P1-5’UTR、P2-5’UTR和P3-5’UTR;根据Poliovirus1strainMahoney、Poliovirus2strainMEF-1和PoliovirusP3/Leon/37基因序列合成并构建的质粒分别命名为突变质粒P1REV-5’UTR、P2REV-5’UTR和P3REV-5’UTR。上述质粒送Invitrogen公司测序,测序结果与参考序列进行比对。1.5病毒提取的提取按照MagMAX-96ViralRNAisolationkit试剂盒说明书提取脊髓灰质炎病毒RNA。1.6病毒转移录1.8用于研究荧光定量pcr方法1.8.1琼脂糖凝胶电泳分别以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型突变质粒和非突变质粒为模板,采用上述方法进行QPCR扩增,产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。由于针对同一型突变株和非突变株QPCR的引物仅有1~2个碱基的差异,为判断该方法是否能够区分出突变和非突变模板,采用突变QPCR或非突变QPCR反应同时检测突变质粒和非突变质粒,分析Ct值之间的差异。1.8.2qpcr扩增条件分别以10倍系列稀释的突变或非突变质粒为模板,按1.7项方法进行突变QPCR扩增或非突变QPCR扩增。该试验在不同时间段重复3次,通过计算Ct值间的变异系数(CV)验证QPCR方法的稳定性。1.8.3qpcr方法检测最低病毒量的测定通过1.8.2项重复性验证结果确定突变QPCR扩增和非突变QPCR扩增检测质粒模板的灵敏度。将3次重复性试验均能成功扩增,且Ct值间的CV小于15%的最小模板量确定为QPCR方法的灵敏度。为验证QPCR方法能够检测到的最低病毒量,将已知滴度的脊髓灰质炎病毒进行10倍系列稀释,按照1.5和1.6项方法逆转录合成cDNA,采用上述建立的方法进行非突变QPCR扩增。该试验在不同时间段重复3次。将3次重复性试验均能成功扩增,且Ct值间的CV小于15%时所对应的最小病毒量确定为非突变QPCR方法的灵敏度。1.9qpcr检测将相同浓度同型别的突变和非突变质粒,以不同体积比进行混合,分别配制Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型理论突变比例(revertantproportion,RP)为1、0.9、0.75、0.5、0.25、0.1、0的混合质粒对照。以混合质粒对照、待测样品cDNA或WHOMAPRECtype3型国际标准品DNA为模板,按1.7项方法分别进行突变QPCR和非突变QPCR扩增,获得突变QPCR和非突变QPCR对应的Ct值(即revCT和nonrevCT)。按照下式计算RP。1.10采用光学定量pcr法确定突变比例1.10.与国外品dna的rp的比较按照1.9项方法测定混合质粒对照或WHOMAPRECtype3型国际标准品DNA的RP,与理论突变比例或标准品标示值进行比较。试验在不同时间段重复3次,计算RP的CV。1.10.2t值与突变率之比的关系网络按照1.9项方法分别测定一系列不同浓度的突变或非突变质粒的RP,分析样品浓度与突变比例的关系。1.11首次应用荧光定量pcr方法来确定突变比例1.11.1.突变比例的测量2结果2.1谷物沉积量的确定构建的6个含脊髓灰质炎病毒5’UTR基因的重组质粒的测序结果显示,插入片段与参考序列一致,可用于后续试验。2.2depc-ter反应Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型突变QPCR和非突变QPCR的反应体系为:2×TaqmanuniversalPCRmastermixwithoutUNG10μl,引物终浓度600nmol/L,探针终浓度200nmol/L,模板DNA2μl,补加DEPC处理水至20μl。反应条件为:95℃10min;95℃30s,56℃30s,72℃30s,共40个循环。在上述条件下,以10倍系列稀释的5~5×102.3用于研究荧光定量pcr方法2.3.1不同突变qpcr反应前后ct值的变化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型突变质粒分别经突变QPCR或非突变质粒经非突变QPCR扩增,产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析,分别可见约130、90和60bp的特异性条带,大小与理论值相符,且除引物二聚体外无其他杂带,见图5。非突变QPCR反应检测非突变模板的Ct值较检测突变模板的Ct值低;相反突变QPCR反应检测突变模板的Ct值较低。其中Ⅱ型非突变QPCR反应对两种模板的区分度略低,但Ct值仍有3~4个循环的差异。而其他QPCR反应对两种模板的区分度较高,Ct值约有10个循环的差异。见图6。2.3.2qpcr扩增效果各浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型突变或非突变质粒进行相应突变QPCR扩增或非突变QPCR扩增的Ct值在3次平行独立试验中重复性良好,CV均小于15%。见表3、4。2.3.3、、型非突变qpcr的灵敏度Ⅰ型非突变QPCR的线性范围为1×10通过3次重复试验确定了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型非突变QPCR的灵敏度分别为0.0843、0.0292和0.2667CCID2.4用光学定量pcr方法确定突变比例2.4.16.该方法能够测定出一系列混合质粒对照的突变比例,且与理论值差异较小,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合质粒的RP检测值和理论值的差异分别为0.0409±0.0374、0.0088±0.0343和-0.0296±0.0268,见图7。QPCR测定的突变比例与标准品的标示值相比具有一定差异,但差异较小,其中WHO1stInternationalStandardforMAPRECanalysisofpoliovirustype3(Sabin)DNA0.9%472-C通过QPCR方法测出的突变比例较标示值高0.0095,而WHO1stInternationalStandard,ControlDNAforMAPRECanalysisofpoliovirustype3(Sabin)通过QPCR方法测出的突变比例较标示值低0.0732,见表5。2.4.2重复性测定结果QPCR测定突变比例的方法具有较好的重复性,除个别样品重复测定结果间的变异系数大于15%外,绝大多数测定结果间的变异系数均小于15%,见表6。2.4.3pcr扩增ct值的确定PCRCt值与RP的关系当样品浓度较高,即样品Ct值较低时,通过QPCR方法测定的RP值与理论值较接近,但当样品浓度较低,尤其是当Ct值大于35时,测定的RP值与理论值的差异明显增大;甚至有可能因为QPCR40个循环内无扩增而无法计算RP。因此,为提高检测结果的准确性,需要保证待测样品的浓度,即待测样品QPCR扩增的Ct值至少应大于35。根据本室保存的病毒滴度结果(数据未显示),待测Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒量至少应分别大于约0.9、0.3和3CCID2.5首次应用荧光定量pcr方法来确定突变比例2.5.1变量比例的测量本室保存的脊髓灰质炎毒株均具有一定程度的回复突变发生,但突变比例较低,且远低于MAPREC试验确定的突变标准,见表7。2.5.2sa排a型pfi经营株Ⅰ型Sabin株480位为G,Ⅱ型Sabin株481位为A,Ⅲ型Pfizer株472位为T;该位置均无回复突变碱基对应的杂峰,见图9。3qpcr检测脊髓灰质炎病毒回复突变的方法的应用脊髓灰质炎是一种由脊髓灰质炎病毒引起的具有较强感染性的疾病,感染对象主要为婴幼儿。初期症状为发热、疲惫、头痛、呕吐、脖颈僵硬以及四肢疼痛。在少数情况下,该病可造成永久瘫痪。由于目前尚无治愈该病的方法,仅能通过接种OPV或IPV来预防研究表明MAPREC试验是在上述待测毒力位点处通过PCR引物引入单一的限制性内切酶酶切位点,该位点在非突变病毒的扩增片段上不存在或为其他酶切位点,以此将突变病毒和非突变病毒区分开。通过PCR、限制性内切酶酶切和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后检测放射性强度,对标记DNA片段进行定量分析,计算回复突变碱基的含量并进行统计学分析,从而对神经毒力进行评价本研究在Troy等通过上述QPCR反应Ct值能够计算出病毒的突变比例,并且检测结果具有一定的准确度和重复性。同时,为了获得准确的检测结果,待测样品的浓度不能过低。目前建立的QPCR方法仅能检测针对Ⅰ型480位的核苷酸改变,无法准确反映Ⅰ型病毒神经毒力的回复突变情况,因此,还需要建立分析Ⅰ型525位核苷酸回复突变的定量PCR方法。并且Ⅰ型和Ⅱ型QPCR反应所用引物与相应的MAPREC国际标准品DNA不匹配,如改变引物和探针序列,使其能利用MAPREC国际标准品作为对照,将更有利于提高该方法的准确性和可行性。此外,本实验还采用建立的QPCR方法对本室保存的脊髓灰质炎病毒进行了突变比例测定,并对其5’UTR进行了测序分析,结果显示,3个型的脊髓灰质炎病毒在5’UTR区均有较低程度的回复突变,但测序峰图显示,毒力位点处均无回复突变碱基对应的杂峰。分析原因是病毒突变比例较低,而测序的灵敏度有限。根据本室相关研究结果,当突变比例大于等于0.1时,可在测序峰图中观察到明显的杂峰。综上所述,本实验中采用QPCR检测脊髓灰质炎病毒回复突变比例的方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度,数小时内即可完成样品突变比例的测定。可用于实验室内部对脊髓灰质炎病毒样品的突变比例测定,为疫苗批一致性评价和猴体神经毒力试验提供参考依据,并可能成为脊髓灰质炎病毒体内或体外神经毒力评价的替代方法。分别采用特异性引物P1-R、P2-R、P3-R,按照Primescript1stcDNAsynthesiskit试剂盒说明书逆转录合成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒cDNA。反应条件为:42℃60min,70℃15min。将突变或非突变质粒稀释至5ng/μl后,进行10倍系列稀释,分别进行QPCR扩增。以10倍系列稀释的质粒浓度为横坐标,循环数为纵坐标,绘制标准曲线。通过优化引物探针浓度及反应条件,确定检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的QPCR方法(以下简称突变QPCR和非突变QPCR)。每次试验均设阴性对照(以DEPC处理水为模板),当阴性对照无扩增时