经典药用植物丁香假单胞菌dc2000甘油激酶基因克隆及功能研究

经典药用植物丁香假单胞菌dc2000甘油激酶基因克隆及功能研究

谭氏反真菌番茄致病性变异（pseudyer亚甲基卤单胞菌（pst）d3000是番茄、青椒和其他茄子植物的病原体。这是属于丁香假单胞菌的。革命兰的阴性短杆菌，有鞭毛，无瘤膜，无芽。最佳ph值为7.0，最佳生长温度为2430，黄绿色荧光在kbm培养基中产生。甘油是一种代谢中间产物,广泛存在于微生物、动物和植物中,参与生物的多种胁迫反应,包括非生物胁迫和生物胁迫甘油在甘油激酶(Glycerolkinase,GK)的催化下,分解形成3-磷酸-甘油(G3P)。G3P在辅酶NAD鉴于GK是甘油代谢中的关键酶,结构相对保守,本研究根据GenBank中PstDC3000GK氨基酸序列(PSPTO_4168)设计引物,通过PCR技术克隆了PstDC3000GK基因,并对其生物信息学特征进行了分析。然后,利用插入突变的方法,敲除PstDC3000GK基因,探讨GK基因缺失对PstDC3000的影响。1材料和方法1.1材料表面1.1.1质粒及试剂野生型PstDC3000、大肠杆菌DH5α、质粒(pK18mob、pLAFR、pRK2073)均由贵州理工学院微生物学实验室保存。克隆载体pMD-18-T购自TAKARA公司。1.1.2化学试剂的制备蛋白胨、甘油、琼脂、常用抗生素购自上海生工生物有限公司;磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、无水乙醇、冰醋酸等均为分析纯,购于广州化学试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司;DNA胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒购于上海生工生物有限公司;TaqDNA聚合酶、ExTaqⅡmastermix、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶等均为TAKARA公司产品。1.1.3培养基1.2测试方法1.2.1pstdc3000扩增gk基因严格参考试剂盒说明书提取PstDC3000基因组DNA,通过核酸紫外分光法分析其质量与浓度。以GenBank中所提交的PstDC3000GK氨基酸序列为依据,利用Primer5.0分析软件,设计1对克隆引物(表1)。以PstDC3000基因组DNA为模板,通过PCR的方法扩增GK基因,扩增条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火60s,72℃延伸90s,35个循环;最后72℃终末延伸10min。PCR结束后,凝胶电泳分析,通过DNA胶回收试剂盒进行纯化,将产物连接至克隆载体(pMD-18-T)上,通过热激法将重组DNA分子转化至DH5α感受态细胞中,Amp抗性和X-gal/IPTG蓝白斑筛选阳性克隆。挑取白色菌落进行PCR检测,将阳性克隆进行液体培养,采用试剂盒方法提取质粒后,双酶切法进行检测,挑选PCR检测与双酶切检测均为阳性的菌落,送上海生工生物公司进行测序。1.2.2orf核心序列的发现与翻译利用生物软件(DNAMAN和BioEdit)对PstDC3000GK基因序列进行ORF查找与翻译。通过序列处理在线工具包(SMS)、瑞士生物信息学研究中心蛋白质专业分析系统以及国际生物测量学与进化生物学实验室在线系统等分析蛋白质理化性质。1.2.3pstdc3000gk氨基酸序列的分析利用整合突变的方式,借助辅助质粒pRK2073,通过三亲本结合实现对PstDC3000GK基因的敲除。方法如下:根据PstDC3000GK氨基酸序列设计缺失突变引物(表1),利用野生型PstDC3000菌体基因组DNA为模板,进行PCR扩增,方法参考1.2.1。分别将受体菌PstDC3000、供体菌(带有重组质粒的DH5α)、辅助菌DH5α/pRK2073接种在含适当抗生素的液体培养基中,培养至OD1.2.4pstdc3000检测根据PstDC3000GK氨基酸序列设计1对GK基因全长回复突变引物(表1)。以PstDC3000菌体基因组DNA为模板,进行PCR扩增,方法参考1.2.1。将构建正确的回复突变质粒通过三亲本结合方式转化至GK基因突变体中,实现GK基因缺失的回复突变。将构建正确的GK基因缺失回复突变体命名为PstDC3000△GK/pLA。1.2.5gk蛋白表达量的检测采用实时荧光定量PCR的方法(罗氏Lightcycler480系统)检测PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA中GK的表达量。以16SRNA为内参,扩增体系:10μmol/L引物各0.8μL,2×SYBRGreenMix10μL,基因组DNA2μL,补水至20μL。扩增程序:95℃预变性3min;95℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环;最后72℃终末延伸10min。按照21.2.6测定细菌生长特性将待测菌株PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA过夜培养,调整至OD1.2.7检测菌株和仪器将待测菌株PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA过夜培养,4000r/min离心2min收集菌体,加入TrisHCl重悬,超声破碎仪破碎菌体细胞,4000r/min离心2min收集上清液,用于HPLC测定。进样体积为10μL;色谱柱为氨基柱;流动相为乙腈∶水(75∶25);流速1.0mL/min;检测器为RID。按照甘油标准品的峰面积值大小分析样品中甘油的含量。1.2.8接种叶片测定将菌株PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA过夜培养至OD选取生长健壮、3周左右的野生型拟南芥(Col-0)叶片,进行接种试验。通过注射器将菌体注入叶片内,擦拭多余菌液,保湿。接种1h(0d)、4d后,打孔器取样,放进已称质量的EP管中。然后再次称质量,计算出叶片的质量。充分磨碎叶片,用MgCl1.3统计分析采用SPSS17.0软件进行方差分析,用Excel中t测试分析数据差异显著性。2结果与分析2.1pstdc3000gk基因的扩增、测序采用试剂盒法提取的PstDC3000基因组DNA,经紫外核酸蛋白仪检测显示,OD以PstDC3000基因组DNA为模板进行PCR反应,扩增得到1条约1500bp大小的特异性条带(图2)。测序结果表明,PstDC3000GK基因全长1506bp,可编码一条501个氨基酸组成的多肽(图3)。BLAST显示,克隆的PstDC3000GK氨基酸序列与GenBank中登录的序列相似性为100%,说明已成功克隆了PstDC3000GK基因。2.2pstcd3000gk序列分析2.2.1gk蛋白质等电点和大小分析瑞士生物信息学研究中心蛋白质专业分析系统在线结果显示,PstDC3000GK蛋白分子质量为55.8ku,等电点为5.54。2.2.2氨基酸n,k,r序列处理在线工具包(SMS)分析结果表明,PstDC3000GK碱性氨基酸(K、R)个数为49;酸性氨基酸(D、E)个数为42;疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)个数为241;极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)个数为157;脂肪族氨基酸(I、L、V)有101个;芳香族氨基酸(F、W、Y)有45个。2.2.3pstdc3000gk蛋白信号肽SignalPV3.0WorldWideWebServer分析显示,PstDC3000GK蛋白信号肽位于N-端第1位与32位氨基酸残基之间,成熟蛋白质为469个氨基酸。2.2.4gk蛋白二级结构的预测国际生物测量学与进化生物学实验室及蛋白质生物学和化学研究所的蛋白质二级结构在线预测结果表明:PstDC3000GK无规卷曲为53.29%,α-螺旋为25.95%,β-折叠为20.76%。2.3gk缺乏对pstcd3000的影响2.3.1dc3000gk基因的缺失表达荧光定量PCR结果显示,通过整合突变后,PstDC3000△GK中GK基因已被敲除,没有表达。回复突变体PstDC3000△GK/pLA中,GK基因已被恢复,表达量接近野生型水平(图4)。2.3.2pstdc3000gk/pla生长速率在M9基本培养基中,PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA均生长良好,说明PstDC3000△GK不是营养缺陷型。但突变体PstDC3000△GK生长速率与PstDC3000相比,明显变慢,回复菌PstDC3000△GK/pLA的生长基本得到恢复,与PstDC3000相比没有差异(图5A)。在TSA(不含甘油)培养基中,PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA的生长速率明显高于M9培养基中的生长速率。同样,GK突变体的生长速率明显降低,而回复突变体的生长速率基本恢复正常(图5B)。在KBM培养基(含甘油)中,PstDC3000△GK的生长速率同样低于PstDC3000和PstDC3000△GK/pLA,且差异明显大于TSA培养基(5C)。2.3.3pstdc3000gk/pla细胞内甘油含量的变化测定结果表明,GK基因缺少导致PstDC3000△GK细胞内积累高浓度的甘油,PstDC3000△GK/pLA细胞内甘油含量基本恢复至野生型水平(图6)。2.3.4pstdc3000gk菌体克隆数试验结果表明,接种野生型Col-0拟南芥4d后,PstDC3000△GK菌体克隆数显著低于PstDC3000,而PstDC3000△GK/pLA菌体数量接近PstDC3000的水平(图7)。3pstdc3000gk基因的缺失引起高效水回复突变体的生长GK催化甘油生成3-磷酸-甘油,是甘油代谢中的关键酶。GK基因先后从大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)等多种微生物细胞中被克隆出来,在大肠杆菌中进行了原核表达,同时酶的结构和性质也得到了分析在本研究中,克隆的PstDC3000GK基因大小1506bp,具有编码501个氨基酸的开放阅读框。PstDC3000GK的分子质量为55.8ku,成熟蛋白由469个氨基酸组成,二级结构中富含无规卷曲,含量高达53.29%。通过敲除PstDC3000GK基因后,菌株在基本培养基和丰富培养基中的生长速率均明显低于野生型,而回复突变体的生长速率基本恢复正常。GK基因缺失后,突变体内积累高浓度的甘油,而高浓度的甘油对细胞有一定的毒害作用,这可能是导致菌体生长缓慢的原因。另外,接种野生型Col-0拟南芥4d后,GK基因缺失突变菌