柚皮多糖的安全性评价

柚皮多糖的安全性评价

1沙田柚的功能桃子也是柑橘。这是云香家族中最重要的水果之一。由于其独特的营养价值，消费者非常喜欢它。广东是柚子生产大省,柚子在广州市和梅州市均属于农业战略龙头产品。柚子的栽培历史悠久,沙田柚在梅州市的总种植面积为40万亩,产量在30万吨以上,是目前全国最大的金柚商品生产基地。1995年,梅州被国家首批百家中国特产之乡组委会命名为“金柚之乡”。李时珍的《本草纲目》中指出,柚子具有很多功效,能治疗消化不良,对酒精中毒有很好的去毒效果,还可以清除肠道中的杂气,而且对毛发具有较好的滋润顺滑作用柚子皮占整个柚子重量的43%到48%,其含有丰富的多酚、异黄酮、多糖和类柠檬苦素等活性物质。柚子的外皮含有香精油和天然色素,白色囊衣富含膳食纤维等,这些成分的含量均高于柚子果实2材料和方法2.1实验材料与小鼠实验用沙田柚采自梅州市梅县区沙田柚生产基地,选择品种和大小相同、果色均匀、成熟度基本一致、无机械损伤且无病虫侵染的柚果作为实验材料。将果皮切成薄片(2cm×2cm)后在恒温干燥箱(50℃)中烘干,粉碎成粉末备用。二级昆明小鼠:6～7周龄,体重18～22g;雄性大鼠:体重180～220g,购自军事医学科学院动物中心。2.2实验仪器与菌株仪器:双人单面超净工作台;DU-730型紫外可见分光光度计(日本岛津分析仪器厂);HH-2恒温水浴锅(北京盈讯智源科技有限公司);ZF-60电热恒温培养箱(上海能共实业有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);BiofiugeStratos台式高速冷冻离心机(克勒格瓦尼(上海)分析仪器有限公司);QYC-200C空气恒温摇床(广州沪瑞明仪器有限公司);BILON-J3菌落计数器(上海华光仪器仪表有限公司);凝胶渗透色谱仪(填料为SephadexG-200,美国Waters公司)。试剂:0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液,Vogel-Bonner(V-B)培养基E,葡萄糖溶液(质量浓度为20%),甲醇、环磷酰胺、阳性诱变剂(4-硝基喹啉-N-氧化物),均购于广州蕊特生物科技有限公司。实验菌株采用TA98和TA100菌株(江苏省疾病控制中心提供),于80℃保存。实验菌株于37℃水浴振荡培养24h,4℃保存。姬姆萨染色液购于青岛海博生物技术有限公司。2.3实验方法2.3.1滤渣的制备称取100g(以干基计)柚子皮粉末,加入2500mL蒸馏水,50℃浸提2.5h后,将浸提液进行抽滤,得到的滤渣重复上述步骤2次,合并滤液,于50℃真空浓缩至500mL,备用。2.3.2取剂的橙色果皮参照史军花等2.3.3前小鼠的饲养及处理采用最大耐受剂量法进行实验。实验用小鼠为二级昆明小鼠(6～7周龄,体重20g左右),包含雄性和雌性(每组10只)。经5d检疫后,饲养于恒温、恒湿环境,将小鼠称重后随机分笼,每笼5只。按照给药(实验组)和未给药(空白组)处理小鼠,处理前小鼠空腹16h。实验组小鼠灌胃最大给药剂量的柚子皮提取物(0.9mL),药物浓度为35.45g/kg,灌胃后连续观察2周,记录小鼠的中毒症状及死亡情况。测试指标包括实验前后小鼠体重的平均值和解剖后的肝脏重量2.3.4增强受试物的耐药性由于鼠伤寒沙门氏菌TA98及TA100具有组氨酸合成缺失突变特征,故可增强受试物渗透进入细胞的能力。TA98和TA100具有细胞壁脂多糖缺失突变和抗性R因子,这会使细菌产生对抗生素的耐药性并增加检测的敏感性。鉴定方法采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验标准判断法(2)多氯联苯玉米油的注射大鼠S9是肝脏或小肠组织匀浆液的去线粒体上清液,含有丰富的药物Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶,被广泛用于评价药物的体外代谢特征和毒理研究(Ames试验)。实验用大鼠腹腔注射多氯联苯玉米油溶液(200mg/mL),注射剂量为500mg/kg。5d后将大鼠处死,取其肝脏称重。用0.15mol/L的KCl溶液洗涤剪碎后的肝组织4～5次,按照肝重:溶液=1:3的比例(g:V)向肝组织中加入0.15mol/L的KCl溶液制成匀浆液,9000g离心10min,取其上清液(S9)分装于塑料管(2mL/管),液氮冷冻保存。(3)空气振荡培养模式在肉汤培养液中接入鼠伤寒沙门氏菌,培养温度为37℃,采用空气振荡(100～120r/min),连续培养约10h。回复突变实验采用平皿掺入试验预保温法(4)基因反应法回复突变菌落计数溶剂通过显微镜观察细菌的背景菌苔,空白(溶剂)对照组和对照组如无明显稀疏,则进行回变菌落计数。如对照组在1个或1个以上测试浓度时,诱发的回复突变菌落数比空白(溶剂)对照组增加1倍以上,且具有剂量依赖关系,可判为阳性反应。任何菌株出现上述阳性反应时,均可判实验结果为阳性。2.3.5小鼠骨髓微核试验按照给药(实验组)和未给药(空白组)处理小鼠,在灌胃的前一晚禁食,自由摄水。采用最大给药剂量0.9mL柚子皮提取物进行灌胃,同时设置空白对照组和环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg,腹腔注射给药)。染色及分析:灌胃36h后颈椎脱臼处死小鼠,取其一侧股骨,剔除肌肉,用纱布擦净附着在股骨上的血污和肌肉,剪去股骨头,用小型止血钳夹紧一端,将骨髓挤出,涂于事先加有一滴牛血清的玻片上,用玻片推片将骨髓推向载玻片另一端,注意推片的角度与压力,使样品中的细胞适度分散且形态良好。玻片晾干后置于无水甲醇中室温固定15min,取出晾干。将固定好的玻片浸入姬姆萨染色液,室温染色5min。染色完毕用蒸馏水冲洗玻片,晾干后于显微镜下观察。微核应易于分辨,在镜下呈圆形或椭圆形,微核大小可达细胞直径的1/3～1/2。每只动物的玻片标本在油镜下至少计1000个嗜多染红细胞(polychromaticerythrocytes,PCE)中的微核细胞数,计算微核率,以千分率表示2.3.6准偏差表示每个指标重复测定3次,所得数据以平均值±标准偏差表示。应用SPSS19.0软件对实验数据进行分析,考察其显著性差异(P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著)。3结果与分析3.1实验组和对照组小鼠的一般情况急性毒性实验中小鼠体重和肝脏重量的变化如表1所示。由表1可知,经过14d的观察,40只小鼠在一次性灌胃后的24h内无死亡,且行为活动均正常;灌胃14d后,小鼠仍全部存活,且实验组和对照组动物的饮水量、采食量及体重均无显著差异;实验结束时,实验组和对照组小鼠的体重无显著差异(P>0.05)。在实验第14d时,将小鼠全部颈椎脱臼处死,解剖发现,其心、肝、脾、肺、肾等主要器官未见颜色及形态异常,也没有出血点或其他病理改变。实验前后实验组小鼠的体重与对照组相比均无显著差异,实验结束后实验组小鼠的肝重与对照组相比也无显著差异。急性毒性实验结果表明,柚子皮提取物的半数致死量(medianlethaldose,LD3.2菌株不能合成组氨酸的培养基上也不能生长鼠伤寒沙门氏菌由于缺乏组氨酸,在营养学上被称为营养缺陷型菌株,这种菌株不能合成组氨酸,如果把其培养在缺乏组氨酸的培养基上,则仅有少数自发回复突变的细菌生长。如果加入外源性致突变物,则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型,改变原来的生长曲线,生长形成菌落,据此判断受试物是否为致突变物3.3关于大鼠骨骼微核率的影响微核(micronucleus,MCN),也叫卫星核,是真核类生物细胞中的一种异常结构,是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式3.4葡萄糖的养分分布3.4.1数字lar新型水热学粗多糖a的凝胶渗透色谱图及数据见图2和表4。从图2和表4可以看出,粗多糖a的凝胶渗透色谱图出现了3个谱峰,分别为峰1、峰2和峰3。利用随机的Breeze软件计算出峰1的重均分子量(weight-averagemolecularweight,Mw)为155000Da,数均分子量(number-averagemolecularweight,Mn)为7360Da,分子量分布宽度(Mw/Mn)为21.1;峰2的Mw为24100Da,Mn为21300Da,峰位分子量(peak-averagemolecularweight,Mp)为28540Da,Mw/Mn为1.13,峰1的分子量是峰2的约70倍左右;其中色谱峰2的数值与本实验室前期采用相同方法研究的经50%乙醇沉淀的蜜柚粗多糖的色谱峰1数值相同峰3的Mw为2130Da,Mn为1890Da,Mp为2540Da,Mw/Mn为1.12。其中,分子量分布宽度的数值比1越大,表明粗多糖的分子量分布越宽,多分散性程度越大3.4.2mw、mp粗多糖b的凝胶渗透色谱图及数据见图3和表4。从图3和表4可以看出,粗多糖b的凝胶渗透色谱图出现了3个谱峰,分别为峰1、峰2和峰3。峰1的Mw为137000Da,Mn为9780Da,Mw/Mn为14.0。峰2的Mw为11700Da,Mn为11200Da,Mp为13540Da,Mw/Mn为1.04。其中色谱峰2的数值与本实验室前期采用相同方法研究的经70%乙醇沉淀的蜜柚粗多糖的色谱峰1数值相同3.4.3粗多糖c的渗透色谱图粗多糖c的凝胶渗透色谱图及数据见图4和表4。从图4和表4可以看出,粗多糖c在色谱柱上的淋洗时间为6～17.5min,粗多糖c的凝胶渗透色谱图中峰1的Mw为39700Da,Mn为6080Da,Mw/Mn为6.53。峰2的Mw为2180Da,Mn为2060Da,Mp为2650Da,Mw/Mn为1.06。4柚子皮提取物中多糖的分子量分布本研究以沙田柚果皮为材料,采用热水浸提制备柚子皮提取物,采用不同浓度的乙醇制备不同分子量的粗多糖。用急性毒性试验、Ames试验及骨髓细胞微核试验评价柚子皮提取物的安全性,用凝胶渗透色谱测定柚子皮提取物中多糖的