灰树花菌丝体-葡聚糖的安全性评价

灰树花菌丝体-葡聚糖的安全性评价

灰木花（又名红景天、碱性），又名栗子苗、莲花、贝叶多孔菌、干佛菌、科其吉、云扇菌、日本舞蹈杆菌等。灰树花为我国部分地区的习用食用菌,有长期食用历史但未发现有害作用。有关灰树花菌丝体β-葡聚糖的毒理和代谢等食用安全性方面的基础研究很少,尤其是特殊毒性研究还很不系统。本研究主要针对灰树花菌丝体β-葡聚糖的食品毒理学进行探讨,以期为灰树花菌丝体β-葡聚糖的应用提供一定的参考。1材料和方法1.1实验动物与仪器受试菌株是从野生环境中的天然菌株分离筛选并经过长期驯化得到的,经中科院微生物所鉴定为灰树花(Grifolafrondosa(Dichs.exFr.)S.F.Gray),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.1709受试物灰树花β-葡聚糖为白色粉末,由灰树花发酵菌丝体提取纯化获得,含量为30%,由山东仁和生物有限公司提供,批号为:20060802。推荐日用量200mg。清洁级昆明种小鼠:7~12周龄,体质量25~30g;清洁级Wistar大鼠:体质量50~70g。均由中国医学科学院医学实验动物研究所动物繁育场提供(许可证号:SCXK11-00-0006)。实验动物使用许可证号:SYXK(鲁)20030006。多氯联苯、疟的平、正定霉素、叠氮钠、丝裂霉素、二氨基芴(2,7-diaminofluorene,2-AF)均为国产医药级。HY318全自动血细胞分析仪法国Celly公司;HITACHI7180全自动生化分析仪日本日立公司;DMLB显微镜徕卡公司;DYML-S50A高压灭菌器北京勤诚盛达科学仪器有限公司;FA2104电子天平上海上天精密仪器有限公司;载玻片、血细胞计数板、匀浆器、容量瓶、冰箱、培养皿、注射器、解剖剪、镊子。1.2方法参照GB/T15193—2003《食品安全性毒理评价程序和方法》1.2.1大、小鼠经口急性毒性试验观察采用最大限量法。选择雌雄小鼠各10只,体质量18~22g。受试物剂量为20g/kgbw,分两次灌胃给予受试物,每次灌胃0.2mL/10gbw,间隔4h,记录动物的中毒表现及死亡情况,连续观察14d。1.2.2小鼠精子畸形实验微生物回复突变实验(Ames实验,平板渗入法)、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验、精原细胞染色体畸变实验与小鼠精子畸形实验均按文献[7-8]进行。各实验所用阴性对照为灭菌蒸馏水,阳性对照为环磷酰胺(40mg/kgbw)。按照《食品安全性毒理评价程序和方法》的要求,Ames实验受试样品的毒性由预实验获得,需设置5个剂量,且最高剂量为5mg/皿;骨髓嗜多染红细胞微核实验受试样品剂量一般取LD1.2.3大鼠食物利用率测量选用体质量50~70g的断乳大鼠80只,随机分成4组,每组20只,雌雄各半。根据人体推荐剂量设立3个实验组,受试物剂量分别为0.1、0.2、0.4g/kgbw(分别相当于人用推荐剂量的30、60、120倍),将受试物掺入饲料中,按照动物体质量的10%计算食物摄入量(即受试物质量占食物质量的0.1%、0.2%、0.4%)饲喂实验动物。对照组大鼠饲喂基础饲料。单笼喂养,自由饮食,每周称质量,记录饲料加入量、剩余量。进食量为加入食物量和食物剩余量的差值,食物利用率=一定时间内动物体质量的增加量/一定时间内动物的进食量。连续观察30d。第30天按照参考文献[7]进行血像、生化指标、脏器系数等指标测定。2结果与分析2.1急性中毒试验的结果灌胃给予受试物后,雌、雄小鼠均未出现中毒症状,14d内实验小鼠无死亡。即该受试物对雌、雄小鼠的急性毒性LD2.2遗传毒性试验的结果2.2.1剂量-反应关系受试物各剂量组的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,也不呈剂量-反应关系。说明在加与不加S-9时,该样品对4株鼠伤寒沙门氏菌实验株TA97、TA98、TA100、TA102均未呈现遗传毒性,即微生物回复突变实验结果为阴性(表1)。2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果经Poisson分布检验结果表明,受试物各剂量组与阴性对照组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率无显著性差异(P>0.05),而阳性对照组与阴性对照组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率有极显著性差异(P<0.01),说明该受试物无致小鼠骨髓嗜多染红细胞微核作用,小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验结果为阴性(表2)。2.2.3小鼠精原细胞染色体畸变实验与小鼠精原细胞染色体畸变实验的相关性由表3可见,受试物各剂量组与阴性对照组小鼠精原细胞染色体畸变率相比无显著性差异(P>0.05),而阳性对照组与阴性对照组小鼠精原细胞染色体畸变率有极显著性差异(P<0.01),说明该受试物无致小鼠精原细胞染色体畸变作用,小鼠精原细胞染色体畸变实验结果为阴性。受试物各剂量组与阴性对照组的小鼠精子畸形率相比无显著性差异(P>0.05),而环磷酰胺阳性对照组小鼠与阴性对照组的小鼠精子畸形率有极显著性差异(P<0.01),该受试物无致小鼠精子畸形作用,小鼠精子畸形实验结果为阴性。2.3大鼠30天的喂养实验2.3.1拒食及正常活动在大鼠30d喂养实验中,各试验组动物均未出现拒食现象,活动正常。由表4、5可知,各实验组大鼠与对照组大鼠的体质量、进食量、食物利用率无显著性差异(P>0.05)。2.3.2蛋白、红细胞及谷丙治疗的基因型指标从表6、7可知,与对照组比较,各实验组大鼠血红蛋白、红细胞总数、白细胞总数及其分类、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌苷、胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白等指标均无显著性差异(P>0.05)。2.3.3脏器异常大体观察各实验组大鼠未发现异常,解剖时亦未发现膀胱、肝总管结石,脏器系数未见异常(表8)。其他脏器如脾、肾、肠、睾丸、卵巢等均未见明显异常。与对照组相比未出现有意义的病理改变。3种毒方法检测细胞染色体损伤本研究中,小鼠急性毒性实验结果表明,受试物灰树花菌株GF-932发酵的菌丝体β-葡聚糖LDICH推荐的遗传毒性实验标准组合是:一项细菌基因突变实验;一项哺乳动物细胞染色体损伤细胞遗传学评价或小鼠淋巴瘤TK检测体外实验;一项啮齿类动物造血细胞染色体损伤实验;这3个组合符合国际有关的遗传毒性实验标准组合食品安全性毒理学评价分为4个