甲基丁香酚对缺氧复氧致人肾小管上皮细胞损伤的影响及机制

甲基丁香酚对缺氧复氧致人肾小管上皮细胞损伤的影响及机制

血液供应中断会导致组织或器官缺氧。立即恢复出血和灌溉。然而，在一些情况下，组织或器官的血流再灌注能进一步加重损伤，即缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury,IRI)。肾脏IRI是导致急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)的常见原因之一，主要表现为氧化应激和炎性细胞浸润细辛属马兜铃科植物，是我国传统中药，已广泛用于风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、痰饮喘咳等血清、细胞白酶及生物安全柜人肾小管上皮细胞株HK-2(上海富衡生物),甲基丁香酚(批号577501,纯度≥98%)、ML385(批号S8790)购自Selleck公司，RPMI1640及无糖RPMI1640细胞培养基购自Gibco公司(批号8120340、MA0555-Aug-24F),二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)购自Sigma公司(批号D-5879),胎牛血清(fatalbovineserun,FBS,批号16140071)、0.25%胰蛋白酶(批号25200056)购自美国ThermoFisher公司，BCA蛋白定量试剂盒(批号P0012S)、RIPA裂解液(批号P0013B)、细胞计数试剂盒(cellcountingkit-8,CCK-8,批号C0037)、活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)检测试剂盒(批号080620201106)、线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,MMP)检测试剂盒JC-1(批号C2006-1)均购自上海碧云天生物技术有限公司，核因子E2相关因子2(nuclearfactorerythroid2relatedfactor2,Nrf2)抗体、血红素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)抗体、NADPH氧化酶4(nicotinamideadeninedinucleotidephosphataseoxidase4,Nox4)抗体购自三鹰公司(批号00063558、00071521、00047480),生物安全柜(中国海尔，型号HR40-IIA2);CO方法hk-2细胞培养和细胞存活率的检测细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，并置于37℃、含5%COme对h-r损伤h-2细胞形态的影响造模结束后，将细胞培养皿置于倒置显微镜下观察、拍照，记录细胞形态改变。细胞ros含量用2′,7′-二氯荧光素乙酸盐(2′,7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,DCFH-DA)荧光探针检测细胞内的ROS水平。造模结束后，去除培养基，PBS洗3遍，加10μmol·Lcck-8复氧在96孔板中于上述不同条件下培养细胞，复氧2h后，将10μLCCK-8溶液添加到每个孔中并孵育1h。使用酶标仪检测450nm处的吸光度(细胞凋亡检测磷脂结合蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)和碘化丙啶(PI)(上海碧云天有限公司，批号A10335)双重染色法用于测量细胞凋亡。收集细胞上清，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞后收集于流式管，300×细胞培养和成像细胞培养在6孔板内，按照MMP检测试剂盒JC-1说明书配制试剂，吸除培养基，加入1mL细胞培养液，再加入1mLJC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min,孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次后，荧光显微镜成像采集图片。MMP正常时以红色荧光为主，MMP下降时以绿色荧光为主，线粒体的去极化程度通过红/绿荧光强度的比例来衡量。聚山梨酯盐系膜的制备提取细胞总蛋白，BCA蛋白质定量试剂盒行蛋白定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)凝胶分离、浓缩蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用含聚山梨酯20(吐温20)的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)溶解脱脂奶粉成5%的封闭液，室温下封闭60min。TBST溶液洗涤后分别加入一抗(Nrf2、HO-1、Nox4稀释1∶1000,正常临床资料将细胞种于细胞爬片上，按计划进行干预后行免疫荧光染色。在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次；0.5%TritonX-100室温通透20min,PBS浸洗玻片3次，在玻片上滴加正常山羊血清，37℃封闭30min;1∶200稀释Nrf2一抗，4℃避光孵育过夜；PBS洗涤3遍后，绿色DyLight488荧光标记的山羊抗兔二抗以1∶100稀释，37℃避光孵育30min,DAPI复染，共聚焦显微镜进行成像拍摄。统计处理所有数据应用SPSS23.0统计软件进行数据分析处理，计量资料以均数±标准差me预处理对hk-2细胞凋亡的影响初步探索不同浓度ME对HK-2细胞毒性，实验分6组，0μmol·L利用DCFH-DA荧光探针检测细胞内的ROS水平，结果显示，H/R模型组荧光强度明显高于NC组；ME给药组ROS平均荧光强度显著低于模型组，表明ME可抑制H/R损伤后细胞内ROS的产生，见图4。利用AnnexinⅤ和PI双重染色，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果表明与NC组相比，模型组HK-2凋亡细胞明显增多；ME给药组可显著降低HK-2细胞凋亡，表明ME预处理可改善HK-2细胞H/R损伤，抑制HK-2细胞凋亡，见图5。通过JC-1染色，检测H/R损伤后HK-2细胞线粒体膜电位改变。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，呈红色荧光；线粒体膜电位下降或丧失，JC-1以单体的形式存在于胞浆，产生绿色荧光。结果显示，与NC组相比，H/R损伤后HK-2细胞绿色荧光增多，红/绿荧光强度降低；经ME处理后，与模型组相比，红/绿荧光强度升高，表明ME可改善H/R损伤后HK-2细胞线粒体膜电位的下降，尤其ME浓度为40μmol·LWesternblot结果显示，与NC组相比，H/R后HK-2细胞Nrf2、HO-1、Nox4上调；经ME预处理，与模型组相比，Nrf2、HO-1表达均增高，Nox4表达下降，差异具有统计学意义(ML385可直接与Nrf2蛋白相互作用，抑制其功能me对nrf2细胞损伤的活性当器官的血液供应中断(缺血),然后重新建立循环(再灌注)时，就会发生缺血-再灌注损伤天然化合物是大量药物的重要来源，目前，植物提取物治疗作用的研究越来越受研究者青睐。植物多酚是一种天然的抗氧化剂，可增强机体抵抗活性氧或活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)的能力，ME是中药细辛挥发油的主要成分，研究表明，其具有多种活性，包括强大的抗氧化作用目前，肾I/R损伤的分子机制尚不完全清楚，肾脏皮质髓质交界处近端肾小管上皮细胞对缺血缺氧敏感，近端肾小管细胞是急性IRI的主要靶细胞正常情况下，Nrf2存在于细胞质中，与(Kelch-likeECH-associatedprotein,Keap-1)结合，并通过蛋白酶体途径迅速降解。氧化应激时，Nrf2会从Keap-1上解离进入核内，激活抗氧化剂反应元件(anti-oxidantresponseelement,ARE)驱动基因综上所述，本研究结果表明，ME可减轻H/R处理的HK-2细胞损伤，其机制可能为ME促进Nrf2信号通路，并抑制Nox4蛋白表达，进而增强细胞抗氧化酶系统，及时清除ROS等有害物质。ME可能是一种有效的减轻IRI的天然化合物。但是，ME潜在机制可能更为复杂，天然化合物的体内作用环境与自然环境不一样，为了将ME的治疗转化为临床用途的可靠策略，未来有必要对ME的天然化学结构进行相应改造，增强其水溶性并降低其药物副作用，并对其功效和作用机制进行深入的研究。3.1me对正常培养中的sh-2细胞活性的影响3.2小鼠叶片主动火炬h/r损伤大鼠细胞活性检测HK-2细胞经氧糖剥夺(oxygen-glucosedeprivation,OGD)诱导24h,复氧2h后,与NC组相比,H/R损伤后细胞活性显著下降(P<0.01);与模型组相比,ME可显著提高H/R损伤后细胞活性(P<0.01),且呈浓度依赖性,在给药浓度20、40μmol·L3.3c组细胞的形态变化HK-2细胞经H/R处理后,倒置显微镜动态观察细胞形态,结果显示与NC组细胞相比,H/R损伤后细胞肿胀,形态变圆、体积增大,细胞间连