中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》

中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在本检验方法规定的条件下，使鲎试剂凝集的内毒素最低浓度为鲎试剂的标记灵敏度，以EU/ml表示。当使用新一批鲎试剂或试验条件发生任何可能影响试验结果的变化时，应进行鲎试剂的灵敏度审查试验。根据鲎试剂灵敏度的标示值（入），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2入、入、0.5入和0.25入四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10imnX75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管轻轻地从恒温器中取出，并缓慢地翻转180度。如果凝胶是在管中形成的，则凝胶不会变形，也不会从管壁上滑落。形成或形成的凝胶不牢固，变形，并从壁上滑落。在保温和取试管的过程中，应避免因振动引起的假阴性结果。当最大浓度2入管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（入c）」入c=1gT（£x/4）□式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当入C在0.5入-2入（包括0.5入和2入）时，可用于细菌内毒素检查，并标记灵敏度入为该批鲎试剂的灵敏度。□干扰试验按表1制备溶液a、b、c和d,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。□只有当溶液a和阴性对照溶液D的所有平行管均为阴性，且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度的复查范围内时，本试验才有效。根据以下公式计算系列溶液C和B的终点浓度的几何平均值（es和ET）。:es=1g—1（Exs/4）et=1g—1（Ext/4）Q其中XS和XT分别是系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当es为0.5入——两个入（包括0.5入和2入），et为0.5es-2es（包括0.5es和2es）时，认为供试品在此浓度下没有干扰效应。如果试验溶液在小于MVD的稀释倍数下干扰试验，则应进一步稀释试验溶液，使其不超过MVD，然后重复干扰试验。□表1凝胶法干扰试验溶液的制备内毒素浓度/内毒素溶液配制号/供试品溶液稀释系数浓度-1248c2入/检验水1248-2入入244444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444零点二五入二入一入零点五入零点二五入D无/检验水-2注：A为试验溶液；B为干扰测试系列；C是鲎试剂标记灵敏度的对照系列；D为阴性对照。可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。新药进行内毒素检查前，或对没有内毒素检查项目的品种建立内毒素检查方法时，必须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。检验方法（1）凝胶限量试验根据表2制备溶液a、B、C和d。使用稀释倍数为MVD的供试品溶液制备溶液A和B,干扰已消除。按鲎试剂灵敏度复核试验操作。表2凝胶限量试验溶液的制备编号：ABCD内毒素浓度/制备内毒素的溶液/无供试品溶液2入/供试品溶液2入/无供检查的水/2222供检查的水平管注：A为供试品溶液；为B供试品阳性对照；C为阳性对照;D为阴性对照。□结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液d的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液b的平行管均为阳性，阳性对照溶液c的平行管均为阳性，试验有效。□如果溶液a的两个平行管均为阴性，则判断供试品符合要求；如果溶液a的两个平行管均呈阳性，则判断供试品不符合要求。如果溶液a的两个平行管中的一个为阳性，另一个为阴性，则需要重新测试。复测时，溶液A应制作四个平行管，如果所有平行管均为阴性，则应判定供试品符合要求；否则，判定供试品不符合要求。（2）凝胶半定量试验该方法通过测定反应终点浓度来量化试样中的内毒素含量。根据表3制备溶液a、B、C和d。按鲎试剂灵敏度复核试验操作。□表3凝胶半定量试验溶液的制备No.a内毒素浓度/制备内毒素的无溶液/供试品溶液1248bc2入/供试品溶液2入/检验水11248dNo/检验水-内毒素浓度-2入2入1入平行管的数量为2222,检查用水为0.5入零点二五入一注：A为不超过MVD且通过干扰试验的试液。从通过干扰试验的稀释倍数开始，用检查水稀释至1、2、4和8倍，最终稀释不得超过MVD。□b为2入浓度标准内毒素的溶液a（供试品阳性对照）。c为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。d为阴性对照。□结果如果阴性对照溶液D的平行管为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管为阳性，且系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值为0.5入一2入，则试验有效。□系列溶液a中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以入，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度（按公式ce=1g-1（£x/2）〕。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。如果试验中试验溶液的所有平行管均为阴性，则应记录内