临床微生物学检验技术公开课一等奖课件省赛课获奖课件

临床微生物学检查技术第1页一、细菌形态学检查不染色标本检查生活状态下细菌动力及运动情况压滴法和悬滴法病原菌初步判定：霍乱弧菌制动试验染色标本革兰染色抗酸染色荧光染色鞭毛染色荚膜染色特殊染色：异染颗粒、芽胞染色、墨汁染色第2页一、细菌形态学检查（一）制片

1.涂片取洁净载玻片一张，用标识笔一分为二，用接种环取生理盐水2环，分别置于玻片两端，接种环灭菌后，取金黄色葡萄球菌斜面培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。接种环灭菌后以同样办法再取大肠埃希菌少许，与另一端生理盐水混匀后涂成均匀薄膜。如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，无须加生理盐水。

第3页2.干燥涂片最佳在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。

3.固定涂片干燥后，将标本片在酒精灯上迅速来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜背面触及皮肤觉轻微烫觉即可。固定目标：①杀死细菌；②使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。第4页涂片干燥固定染色镜检第5页（二）革兰染色法1.原理

（1）革兰阳性细菌细胞壁构造较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁构造较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。

（2）革兰阳性菌等电点低，革兰阴性菌等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷结晶紫染料结合较牢靠不易脱色。

（3）革兰阳性菌细胞内具有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢靠结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含很少许核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。第6页2.染色办法（1）标本涂片、干燥和固定。

（2）染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴，室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。

（3）标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后用油镜观测。

第7页第8页3.成果紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌。第9页（二）抗酸染色1.原理分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成份为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢靠，能抵抗酸性乙醇脱色作用，因此抗酸菌能保持复红颜色，达成染色目标。第10页2.办法（1）萋纳石炭酸复红染色，加温促使菌体着色5min；（2）流水冲洗，3%盐酸酒精脱色1~3min；（3）吕氏美蓝复染30s。第11页第12页3.成果未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌,脱色经复染呈蓝色细菌为非抗酸性细菌。第13页（三）鞭毛染色1.原理细菌鞭毛能被碱性复红酒精饱和溶液着色，是由于在染色过程中伴随酒精蒸发其染料沉积在鞭毛上，使鞭毛着色。碱性复红作为主要染料，而丹宁酸为媒染剂。第14页2.办法（1）采取点种法接种变形杆菌（或其他鞭毛菌），近离接种点菌，鞭毛细，菌体较短；远离接种点菌，鞭毛粗，菌体长，用无菌接种环取远离接种点菌混悬于盛有没有菌蒸溜水平皿内，不要研磨以免鞭毛脱落，置室温放置10～15min，使鞭毛膨大。

（2）用毛细滴管将菌液滴于洁净玻片上，迟缓倾斜玻片任菌液流开，始之成为均匀薄膜，将玻片置37℃温箱内，任其自然干燥，切勿用火焰固定。

（3）在干燥标本片上滴加鞭毛染色液1～2滴，使覆盖于薄膜上，作用1～2min后轻轻用水冲，干后镜检观测。第15页3.成果菌体染成红色（或深紫色），鞭毛染成淡红色（或淡紫色），染色时间越长，鞭毛越粗。第16页（四）荚膜染色1.原理荚膜为细菌细胞壁外围黏液层，对染料亲和力很低，用一般染色不易着色，必须通过荚膜染色办法或衬托染色，方能清楚识别出荚膜。2.办法用有荚膜细菌培养物涂片，火焰固定，固定标本后加1%结晶紫染液，室温保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸铜水溶液冲洗染液，勿水洗。待干后镜检观测。第17页3.成果菌体为深紫色，荚膜为无色或淡紫色。第18页（四）墨汁染色1.原理

2.办法

第19页3.成果菌体为深紫色，荚膜为无色或淡紫色。第20页（一）培养基分类成份用途形态

血平板巧克力血平板第21页伊红美蓝平板

麦康凯平板

SS平板M-H平板第22页培养基选择根据标本起源和也许存在病原菌血平板巧克力血平板中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板麦康凯平板SS琼脂碱性琼脂或TCBS琼脂血液增菌培养基营养肉汤第23页分离培养细菌分离平板划线分离法斜面接种法液体接种法穿刺接种法倾注培养法涂布接种法第24页二、分离培养（一）划线接种1.办法斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法。斜线法第25页曲线法方格法第26页放射法四格法第27页第28页分离培养细菌培养办法需氧培养法二氧化碳培养法厌氧培养法第29页三、生化反应酶系统对底物分解能力代谢产物掌握多种生化反应原理和应用是细菌判定基础第30页三、生化反应（一）碳水化合物代谢试验

1.糖（醇、苷）类发酵试验

原理：不一样种类细菌具有发酵不一样糖（醇、苷）类酶，因而对多种糖（醇、苷）类代谢能力也有所不一样，虽然能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气能力，可用以判定细菌种类。

办法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）特定糖（醇、苷）类。所使用糖（醇、苷）类有很多种。将待判定纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时后，观测成果;若用微量发酵管，或要求培养时间较长时。第31页

成果：能分解糖（醇、苷）产酸细菌，培养基中批示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气细菌可在小倒管（Durham小管）中产气愤泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。

应用：是判定细菌最主要和最基本试验，尤其对肠杆菌科细菌判定尤为主要。第32页2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(O-F试验）

原理：细菌在分解葡萄糖过程中，必须有分子氧参与，称为氧化型；能进行无氧降解为发酵型；不分解葡萄糖细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区分细菌代谢类型。

办法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种1支HL培养管中，从培养基表面穿刺到其底部。置35℃孵箱孵育48h以上。第33页

成果：培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。1为产碱型2为氧化型3为发酵型

应用：主要用于肠杆菌科与其他非发酵菌鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。第34页3．甲基红（MR）试验

原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸深入被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5下列时，加入甲基红批示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生酸深入转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红批示剂呈桔黄色。

办法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红批示剂，立即观测成果。第35页

成果判定：展现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。

应用：常用于肠杆菌科内某些种属鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。第36页4．Β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能迅速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖迅速发酵和迟缓发酵细菌均可迅速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属鉴别。

办法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观测成果。第37页成果：展现亮黄色为阳性，无色为阴性。第38页

应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌迅速判定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖细菌均可短时间内展现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。第39页5．VP试验

原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸深入脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中精氨酸等含胍基物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。

办法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml400g/LKOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观测成果。第40页

成果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性第41页

应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性细菌，后者常为阴性，反之亦然。第42页6．胆汁七叶苷水解试验

原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷能力。七叶苷被细菌分解生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁二价铁离子发生反应形成黑色化合物。

办法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育18~24h后，观测成果。

成果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。

应用：主要用于鉴别肠球菌与其他链球菌区分，以及肠杆菌科某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）初步鉴别。肠球菌本试验为阳性。第43页（二）细菌对于蛋白质和氨基酸代谢试验

1.明胶液化试验

原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体明胶培养基成为流动液体。办法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d，逐日观测成果。若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观测成果前，先置4℃冰箱内30min，再看成果。第44页

成果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌鉴别，如沙雷菌、一般变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。第45页阴性阳性第46页2.吲哚（靛基质）试验

原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）后则形成红色玫瑰吲哚。培养基：蛋白胨水培养基。办法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。成果：于二者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌判定。第47页第48页3.硫化氢试验

原理：某些细菌能分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色硫化铅或硫化铁沉淀。此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。培养基：醋酸铅培养基。办法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48h观测成果。第49页

成果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中属及种鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。第50页第51页4.尿素分解试验

原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量氨，使培养基呈碱性。培养基：尿素培养基。办法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养18～24h观测成果。成果：培养基呈碱性，使酚红批示剂变红为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌判定。奇异变形杆菌和一般变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。第52页阳性阴性阴性第53页5.苯丙氨酸脱氨酶试验

原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。办法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35℃培养18～24h，滴加10％三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。第54页

成果：出现绿色为阳性。应立即观测成果，延长反应时问会引发褪色。加氯化铁试剂出现绿色为阳性第55页

应用：主要用于肠杆菌科细菌判定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。第56页6.氨基酸脱羧酶试验

原理：具有氨基酸脱羧酶细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使批示剂显示出来。培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。办法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35℃培养1～4d，每日观测成果。第57页

成果：孵育后，对照管应呈黄色，测定管呈紫色（批示剂为溴甲酚紫）为阳性；若测定管呈黄色为阴性。若对照管展现紫色则试验无意义，重新做试验。氨基酸对照鸟氨酸赖氨酸鸟氨酸为阳性赖氨酸为阴性氨基酸对照第58页

应用：主要用于肠杆菌科细菌判定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其他沙门菌赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。第59页（三）碳源和氮源利用试验

1.枸橼酸盐利用试验

原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。培养基：枸橼酸盐培养基。办法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃培养1～4d，每日观测成果。第60页

成果：培养基中溴麝香草酚兰批示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。第61页

应用：用于肠杆菌科中菌属间判定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属一般为阳性。第62页2.丙二酸盐试验原理：丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌判定中一种鉴别性特性。许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环一种步骤，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，因此琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。培养基：丙二酸盐培养基接种：用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养1～2d，观测培养基变色情况。观测成果：如测定培养基生长并变蓝色，表达可利用丙二酸盐，为阳性成果；如测定培养基未变色，则为阴性，即不利用丙二酸盐。第63页2.丙二酸盐利用试验

（1）原理：有细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变碱。（2）培养基：丙二酸盐培养基。（3）办法：将被检菌接种于上述培养基，35℃培养24～48h后观测成果。（4）成果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。（5）应用：肠杆菌科中属间及种鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。第64页（四）氧化酶试验

原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统最后呼吸酶。具有氧化酶细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色醌类化合物。试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。办法：

1.菌落法直接滴加试剂于被检菌菌落上。

2.滤纸法取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。

3.试剂纸片法将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。第65页

成果：细菌在与试剂接触10秒内呈（二甲基对苯二胺盐酸盐为紫红色，四甲基对苯二胺盐酸盐为蓝色）为阳性。分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。第66页（五）触酶试验原理：具有过氧化氢酶细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成份子氧出现气泡。试剂：3%过氧化氢溶液。办法：取菌落置于洁净试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液细菌培养物中，立即观测成果。成果：有大量气泡产生者为阳性。不产气愤泡者为阴性。应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌初步分群。第67页第68页（六）硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐替代氧作为呼吸酶系统中终末受氢体。能使硝酸盐还原细菌从硝酸盐中取得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原过程因细菌不一样而异，有细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态铵；有细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生亚硝酸。培养基：硝酸盐培养基。试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸100ml；乙液（α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml）。办法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养1～4d，将甲、乙液等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观测成果。第69页

成果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，也许是：

1.硝酸盐没有被还原，试验阴性；

2.硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而造成假阴性成果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表白试验确实为阴性。若仍不产生红色，表达试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表达有氮气生成医`学教育网搜集整顿。应用：本试验在细菌判定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。第70页第71页（七）DNA酶试验原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。由于长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于酸，因此当菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现透明环。培养基：0.2％DNA琼脂平板。办法：将被检菌点种于上述平板上，于35℃培养18～24h，用lm