生物制药 发酵工程制药公开课一等奖课件省赛课获奖课件

发酵工程制药张忠山第1页为何要利用微生物抗生素、氨基酸、酶制剂等产品为何能通过微生物发酵来生产？这与微生物生长和代谢特点有什么关系？第2页1、某些微生物因争夺生存环境或营养物，会产生抗生素将其他种类微生物杀死。2、微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营养物质水解成可吸取小分子多肽或氨基酸、葡萄糖。3、微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需某些物质，包括氨基酸、核苷酸等。第3页微生物长处微生物繁殖非常迅速微生物培养易于控制微生物本身也容易改造第4页微生物发酵发酵：利用微生物，在合适条件下，将原料通过特定代谢途径转化为人类所需要产物过程。发酵工程：采取当代化工程技术伎俩，利用微生物某些特定功能，为人类生产有用产品，或直接把微生物应用于工业生产过程一种新技术。第5页微生物应用酒类：包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用酿酒酵母，在厌氧条件下进行发酵，将葡萄糖转化为酒精生产。白酒通过蒸馏，因此酒主要成份是水和酒精，以及某些加热后易挥发物质，如多种酯类、其他醇类和少许低碳醛酮类化合物。果酒和啤酒是非蒸馏酒，发酵时酵母将果汁中或发酵液中葡萄糖，转化为酒精，而其他营养成份会部分被酵母利用，产生某些代谢产物，如氨基酸、维生素等，也会进入发酵酒液中。因此，果酒和啤酒营养价值较高。

第6页微生物应用醋：食品店或超市发售醋中，除了白醋是由化学合成食品级醋酸勾兑外，其他则是由醋酸菌在好氧条件下发酵，将固体发酵产生酒精转化为醋酸生产。由于使用微生物菌种或曲种差异，在葡萄糖发酵过程中会产生乳酸或其他有机酸，因而使醋有不一样风味。

第7页微生物应用酱油：酱油生产以大豆为主要原料，其他有麦麸、小麦、玉米等，将上述原料经粉碎制成固体培养基，在好氧条件下，利用产生蛋白酶霉菌，如黑曲霉进行发酵。微生物在生长过程中会产生大量蛋白酶，将培养基中蛋白质水解成小分子肽和氨基酸，然后淋洗、调制成酱油产品。酱油富含氨基酸和肽，具有特殊香味。

第8页微生物应用酱：以大豆和少许面粉为原料，蒸煮后在空气中自然发酵。发酵过程主要是能够产生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶霉菌，将大豆中蛋白质、脂肪、淀粉分解，产生出氨基酸、多肽、甘油、脂肪酸等多种物质。这些物质使酱具有独特酱香味。第9页微生物应用酸奶：牛奶在厌氧条件下，由乳酸菌发酵，将乳糖分解，并深入发酵产生乳酸和其他有机酸，以及某些芳香物质和维生素等；同步蛋白质也部分水解。因此，酸奶是营养丰富、易消化，少含乳糖，是适合于有乳糖不适应症者优良食品。

第10页微生物应用醪糟：又称酒酿，是大米经蒸煮后，接种根霉，在好氧条件下，发酵生产含低浓度酒精和不一样糖分食品。根霉在生长时会产生大量淀粉酶，将大米中淀粉水解成葡萄糖，同步利用部分葡萄糖发酵产生酒精。由于使用根霉菌种不一样，能够生产不一样酒精度、不一样甜度和不一样香味醪糟。

第11页微生物应用面包：目前面包均是利用活性干酵母（面包酵母）经活化后，与面粉混合发酵，再加入多种添加剂，经烤制生产。面粉发酵后淀粉构造发生变化，变得易于消化、营养易于吸取。第12页微生物应用馒头：此前做馒头面粉是经自然发酵后蒸制，假如连续使用面肥发酵，经几代发酵，微生物会因生长优势而单一化。发酵菌种一般多为乳酸菌。由于发酵产酸，在蒸制前要用碱中和酸，制得馒头才松软适口、带有特殊香味。目前，大批量生产是采取干酵母发酵，因此不产酸，不需要再用碱中和即可蒸制。第13页微生物应用制药业：抗生素、氨基酸、维生素生产；食品业：醋、酱油、酱、酒等生产；轻工业：柠檬酸、乳酸、味精、肌苷酸、干酵母、色素、黄原胶、甘油等生产；化工业：酒精、丙酮、丁醇、衣康酸、丙烯酰胺和聚丙烯酰胺等生产；饲料业：饲料添加剂生产；农药业：农用抗生素、微生物肥料、微生物农药等生产。第14页

发酵工程是一门具有悠久历史，又融合了当代科学技术，是当代生物技术组成部分。本章主要介绍发酵工程基本内容和基本原理，重点介绍了工业发酵工艺流程,还介绍了典型产品发酵生产工艺，如青霉素，谷氨酸和维生素C生产。第15页

微生物发酵制药是利用微生物进行药品研究、生产和制剂综合性应用技术科学。研究内容包括微生物制药用菌选育，发酵以及产品分离和纯化工艺等。主要讨论用于各类药品发酵微生物起源和改造、微生物药品生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数确实定、药品发酵过程优化控制、质量控制等。第16页第一节微生物发酵概论1857年巴斯德提出著名发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用成果。”1929年Flemming爵士发觉了青霉素，增加一大类新产品-抗生素。一、微生物发酵概念及发展史第17页20世纪40年代，以获取细菌次生代谢产物-抗生素为主要特性抗生素工业成为微生物发酵工业技术支柱产业。20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为微生物技术产业又一种组员，实现了对微生物代谢进行人工调整，这又使微生物技术进了一步。第18页20世纪60年代，微生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。20世纪70年代，为理解决由于人迅速增加而带来粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。第19页80年代以来，伴随重组DNA技术发展，能够按人类社会需要，定向培养出有用菌株，这为微生物发酵技术引入了遗传工程技术，使微生物技术进入了一种新阶段。目前，人们把利用微生物在有氧或无氧状态下生命活动来制备微生物菌体或其他代谢产物过程统称为发酵。第20页

1.微生物菌体发酵

是以取得具有某种用途菌体为目标发酵。用于面包制作酵母发酵及用于人类或动物食品微生物菌体蛋白发酵是比较传统菌体发酵工业。新菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存冬虫夏草菌、与天麻共存密环菌等药用菌。二、微生物发酵类型第21页2.微生物酶发酵

酶普遍存在于动物、植物和微生物中。由于微生物种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点，因此目前工业应用酶大多来自微生物发酵。如用于抗癌天冬酰胺酶和用于治疗血栓纳豆激酶和链激酶等。第22页

3.微生物代谢产物发酵

微生物代谢产物很多。在菌体对数生长期所产生产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质和糖类等是菌体生长繁殖所必需，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成某些具有特定功能产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无显著关系，叫做次级代谢产物。

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4.微生物转化发酵

微生物转化是利用微生物细胞一种或多种酶，把一种化合物转变成构造有关更有经济价值产物。可进行转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、脱氨反应等。

第24页5.生物工程细胞发酵是指利用生物工程技术所取得细胞，如DNA重组“工程菌”，细胞融合所得“杂交”细胞等进行培养新型发酵。此类发酵产物多种多样，如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素等。第25页优良微生物菌种是发酵工业基础和关键，微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为最多。1.从微生物分类学角度把所需菌种分为：细菌类如短杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等；酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、汉逊酵母和假丝酵母等；霉菌如黄曲霉、红曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放线菌如多种抗生素，链、庆大等。三、微生物发酵工业所用菌种第26页

2.作为工业微生物发酵使用菌种，一般有下列特点：(1)具有稳定遗传学特性。(2)微生物生长和产物合成对于基质没有严格要求。(3)生长条件易于满足。(4)具有较高多种酶活力。（5）对于包括体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目标产物分离提出时，则易破碎。第27页1.微生物发酵过程是一种典型化工过程。2.微生物发酵过程是一种典型代谢控制发酵。3.微生物发酵工业又是一种有别于化工过程一种工业。四、微生物发酵基本特性第28页啤酒制造工艺流程第29页

啤酒制造工艺流程第30页

微生物发酵主要有下列几个特性：（1）反应条件温和。一般由于微生物生理特性，要求温度为30℃～40℃、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放线菌发酵和pH值中性偏碱性如细菌发酵。（2）无菌发酵，整个反应过程要求无菌。培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。第31页（3）非连续性生产。微生物生理特性决定了发酵过程非连续性，大部分工业发酵是以间歇操作为基础进行，目前能够实现连续化生产是啤酒连续化生产。第32页第二节工业发酵工艺流程

生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种选育、菌种培养基配制、扩大培养和接种、发酵过程下游处理即分离提纯等几个过程。第33页找到合适菌种是发酵工程前提。人们最初是从自然界寻找所需要菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌等。但这种办法得到菌种，产量一般都比较低。20世纪40年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求优良菌种。随着细胞工程、基因工程等技术日益成熟，科学家开始构建工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微生物所不能生产产品。一、菌种选育第34页菌种选育必要性和主要性

必要性：1、经诱变剂处理细胞中只有一部分是突变型菌株，而有害突变往往占有很大百分比；2、从自然界筛选得来菌株，药品代谢合成能力均很低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条件下，产物浓度很低，对于工业生产来说，假如不进行菌种改良，势必造成生产成本过高。第35页主要性：1、菌种选育是提升单位产量和改善产品质量主要措施；2、能够变化菌种某些遗传性状，使之更适合于工业生产，例如抗噬菌体菌株能利用便宜发酵原料或需氧量较小菌株等。第36页选育办法1、自然选育：是指微生物细胞群体不通过人工处理而利用菌种自发突变（spontaneousmutation）进行菌种筛选育种办法。效率低、进展迟缓。第37页2、诱变育种：是用不一样诱变剂（mutagen）处理微生物细胞群体，以诱发多种遗传突变，然后采取简便、迅速和高效筛选办法，从中选出所需要突变株（mutant）。发酵工业中使用高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提升了生产性能菌株，故至今仍是菌种改良主要办法。第38页（一）办法和原理A.诱变机制（1）微小损伤突变：碱基置换，码组移动（2）染色体畸变：易位，逆位，缺失，反复（3）染色体组突变：数目变化（单倍体变多倍体）B.诱变剂及其作用方式：物理诱变剂，化学诱变剂，生物诱变剂常用诱变剂p-263第39页（二）诱变和筛选初步筛选是关键步骤A.本身耐药突变株：耐受本身分泌抗生素，提升产量B.构造类似物或前体类似物耐受突变株：解除反馈抑制第40页C.营养缺陷型及其回复突变株通过诱变造成某些基因突变，而需要添加某些物质（氨基酸、核苷酸等）才能生长突变体。营养缺陷型作用：（1）解除末端产物反馈调整作用。（2）作为标识，在杂交育种中作为出发菌株有助于杂交重组分析。（3）作为基因工程受体菌，检出克隆基因体现。第41页3、杂交育种：是将两个基因型不一样亲株某些遗传信息，通过杂交重组于同一重组体中，形成新遗传型个体过程。传统杂交育种在真核微生物中能够通过有性杂交及准性杂交两种途径；在原核微生物中（如细菌和放线菌）则可通过接合杂交进行。第42页a.准性生殖（parasexualreproduction）：是指真菌中不通过有性生殖基因重组过程。b.接合（conjugation）：在细菌和放线菌中，接合是最常见杂交方式。二亲株细胞在固体培养基上混合培养时，一亲株细胞基因组片段进入另一亲株细胞，发生部分染色体转移或遗传信息交换，形成部分合子，通过二次交换形成单倍重组体。第43页c.原生质体融合（protoplastfusion）：两亲本菌株原生质体在高渗条件下混合，以聚乙二醇作为助融剂，或在一定电场条件下，通过电脉冲作用促进原生质体互相聚集，诱导融合，接着两亲本遗传物质交换，从而实现遗传重组。在合适条件下，融合细胞可再生成新完整细胞，就有也许取得具有合乎抱负新遗传性状重组子。第44页二、发酵基本过程基本过程为：菌种种子制备发酵发酵液预处理提取精制第45页第46页菌种发酵工程中所用菌种多要求是纯培养，即整个发酵过程不能混有杂菌，不然将造成产量大大下降，甚至得不到产品。例如，假如青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌会分泌青霉素酶，将形成青霉素分解掉。因此，培养基和发酵设备都必须通过严格灭菌。第47页种子制备在摇瓶或小罐内进行。种子罐一般用钢或不锈钢制成，相称于小型发酵罐。接种前所有设备及培养基要通过严格灭菌。在大规模发酵生产中，需要将选育出优良菌种通过数次扩大培养，让它们达成一定数量后来，再进行接种。第48页发酵接种量：5-20%通气量：0.3-1m3/m3搅拌功率消耗：1-2kW/m3罐温：26-37℃罐压：0.3-0.5kg/cm2发酵周期：2～8d第49页第50页第51页发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求产品。对发酵产品要求不一样，分离提纯办法也对应有些区分。利用发酵工程生产产品有菌种代谢产物和菌种本身（如酵母菌和细菌）两大类，假如产品是菌种，分离办法一般是通过过滤、沉淀从培养液中分离出；假如产品是代谢产物，则采取蒸馏、萃取、离子交换等办法提取。分离提纯后产品，还要通过质量检查合格后，才能成为正式产品。产物提取第52页发酵方式1、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭菌、接种、发酵。特点：一次性；发酵过程中，营养不停减少，微生物不停增殖，环境非稳态；微生物生长四个时期显著；应用广泛，改善（在线检测，计算机控制）。第53页2、补料分批发酵：补加新鲜培养基。特点：能够解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长；提升有用产物转化率；应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业；第54页3、连续发酵：恒化器（基质恒）、恒浊器（菌体密度恒），连续进料出料平衡，保持恒定发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇发酵。长处：操作稳定；利于机械、自动化；提升设备利用率；减少灭菌次数；易于过程优化。缺陷：易染菌；微生物易变异；对产品类型适应性不广；对设备及附件要求高。第55页第三节发酵工艺控制一、培养基影响及其控制二、温度影响及其控制三、溶氧影响及其控制四、pH影响及其控制第56页一、培养基影响及其控制

1、碳源：糖类，脂肪，有机酸，碳氢化合物（速效碳源葡萄糖；迟效碳源淀粉，乳糖）（菌体干物质50%以上是碳）。主要功能：①提供能源；②菌体成份；③产物碳架；起源：葡萄糖、糖蜜、淀粉及水解物是常用碳源。第57页2、氮源：无机氮源，有机氮源（速效氮源氨基酸，玉米浆；迟效氮源黄豆饼粉，花生饼粉、棉籽饼粉）。速效促生长，迟效利代谢。（占干物质量10%）。主要功能：①组成细胞物质。②组成产物。起源：花生粉、黄豆饼粉、玉米浆、铵盐、硝酸盐、尿素和氨水等是常使用氮源。第58页3、无机盐和微量元素

主要功能：①组成菌体成份（S）②激活酶（Mg2+）③辅酶或辅基组成部分④参与能量转移反应⑤调整渗入压、pH、氧化还原电位起源：无机盐、原料、灰分。4、特殊生长因子：不可缺、量微，本身不能合成或量不够。主要功能：①组成辅酶②促进生命活动起源：玉米浆、糖蜜、甜菜糖、麸皮、米糠。第59页5、水：物质溶解和生化反应基础。功能：①机体主要组成成份；②参与某些代谢反应；③良好溶剂（介质）和热导体；6、发酵培养基配制提供必要营养成份；配制合适浓度；主成份与其他成份配比；控制合适pH第60页二、温度影响及其控制

1.影响发酵温度变化原因（1）生物热：生长，呼吸，繁殖（2）搅拌热：摩擦（3）蒸发热：（4）辐射热：罐内外温差第61页2.温度选择与控制（1）最适温度：生长温度，生产温度变温发酵，如青霉素发酵：30℃5h25℃35h20℃85h25℃40h放罐；青霉素产量比25℃恒温发酵高14.7%。（2）温度控制一般不需加热，冷却水（冷冻盐水）通过夹层循环冷却。第62页

三、溶氧影响及其控制1.溶氧影响：最适氧浓度溶氧对菌体生长和产物性质及产量都影响谷氨酸发酵VB12发酵天冬酰胺酶发酵第63页2.发酵过程溶氧变化红霉素发酵：前期，中期，后期溶氧异常下降（污染好气杂菌，菌体代谢异常），溶氧异常升高（污染噬菌体）3.溶氧浓度控制供氧方面（提升氧传递）；需氧量（菌体浓度，基质种类，培养条件）第64页四、pH影响及其控制1.

pH对发酵影响最适生长pH（3～6）最适生产pH2.pH变化3.发酵pH确实定和控制（1）发酵pH确实定：菌种，培养基组成，培养条件，温度（2）pH控制：补料，酸，碱，尿素，测定代谢曲线pH变化，稳定工艺条件。常用控制办法有：①调整生理碱性和酸性盐类百分比；②选择不一样C、N种类和百分比；③添加缓冲剂。

第65页第四节发酵产物提取一、吸附法二、沉淀法三、溶剂萃取法四、离子交换法第66页第67页培养液预处理目标在于变化培养液性质，使其便于过滤和提取。细胞